真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书

主要用途
真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂是一种旨在通过细胞色素C氧化酶反应系统中还原性细胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种真菌或酵母细胞株裂解悬液中细胞色素C氧化酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
细胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase）存在于真核生物的细胞线粒体上（包括真菌和酵母细胞），主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。基于底物还原型细胞色素C（reduced cytochrome c），受到细胞色素C氧化酶的催化，转化为氧化型细胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度仪下，出现吸光值的变化（550nm 波长），由此定量测定细胞色素C氧化酶的活性。细胞色素C氧化酶反应系统为：

产品内容
裂解液（Reagent A）      毫升
强化液（Reagent B）        毫升    
活性液（Reagent C）        微升
缓冲液（Reagent D）     毫升
反应液（Reagent E）     毫升
稳定液A（Reagent F1）    管
稳定液B（Reagent F2）    微升
产品说明书        1份

保存方式
强化液（Reagent B）和缓冲液（Reagent D）保存在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备
15毫升锥形离心管：用于真菌/酵母细胞收集的容器
1.5毫升离心管：用于真菌/酵母细胞裂解操作或反应液配制的容器
台式离心机：用于沉淀真菌/酵母细胞
微型台式离心机：用于真菌/酵母细胞裂解悬液澄清
比色皿：用于比色检测的容器
分光光度仪：用于比色分析
 
实验步骤
一、样品准备
1．准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升）
2．移入到预冷的15毫升锥形离心管
3．置于冰槽里5分钟
4．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
5．小心抽去上清液
6．加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀
7．转移到预冷的1.5毫升离心管
8．加入xx微升强化液（Reagent B）（注意：参见注意事项3）
9．加入xx12.5微升活性液（Reagent C）
10．强力涡旋震荡15秒
11．置于冰槽里1分钟
12．重复实验步骤10至11五次
13．加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀
14．放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
15．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
16．移取5微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
17．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测读准备
1．准备好上述制备好的样品，置于冰槽里融化
2．设定好分光光度仪：温度28℃，波长550nm，间隔10秒，测读7次（共60秒），并置零或设置0秒和60秒各测读1次
3．实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的稳定液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出xx微升到稳定液A（Reagent F1）管里，混匀后，标记为稳定工作液，置于冰槽里备用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent E）置入冰槽里融化，然后移出100微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稳定工作液，轻柔混匀后，室温下暗室里静置至少15分钟（可见颜色变化），置于冰槽里，标记为反应工作液（注意：参见注意事项6），放在暗室里
4．缓冲液（Reagent D）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent D）到新的1毫升比色皿
2．加入xx微升裂解液（Reagent B）
3．上下倾倒数次，混匀
4．室温下孵育2分钟
5．放进分光光度仪，置零
6．取出比色皿，加入xx微升含有反应液（Reagent E）和稳定液（Reagent F）的反应工作液
7．上下倾倒数次，混匀
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0秒读数－60秒读数），正常读数差值为0.001至0.005

四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent D）到新的比色皿
2．加入100微升待测样品（注意：建议总量50微克总蛋白，且样品需澄清）
3．上下倾倒数次，混匀
4．室温下孵育2分钟
5．放进分光光度仪，置零
6．取出比色皿，加入xx微升含有反应液（Reagent E）和稳定液（Reagent F）的反应工作液
7．即刻上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0秒读数－60秒读数），通常活性读数差值为正数

四、计算样品活性

注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．样品中忌用DTT和巯基乙醇等处理
4．强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用1毫升枪头，将尖端部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满；或秤重0.1克
5．建议测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用 Bradford蛋白质浓度定量检测试剂盒（G&VS30030.1）
6．每增加1个样品，增加反应工作液为：反应液（Reagent E）50微升＋稳定工作液1.5微升，以此类推。配制反应工作液时，须根据样本数量配制实际工作液容量
7．系统操作过程中，背景测定只需1次
8．分光光度计波长严格设置在550nm，误差10nm将不产生信号
9．加样后3秒内进行比色测定
10．比色测定后，比色皿须清洗彻底
11．背景空对照0秒读数通常0.2至0.8为理想状态
12．背景空对照的正常读数差值（0秒－60秒）通常为0.001至0.005（正负即可）
13．样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致
14．样本测定60秒读数低于0秒读数表明具有酶活性
15．酶活性单位浓度定义：在28℃室温下，pH 7.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）氧化1微摩尔的细胞色素C
16．建议待测样本总蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，即60秒读数不变或为零，则可以增加或降低样本量（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒G&VS30030.1）
17．本公司提供系列细胞色素相关试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号            名称                规格        
G&VS10014.5    真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒        20次    
G&VS10014.5A    裂解液（Reagent A）                毫升
G&VS10014.5B     强化液（Reagent B）                毫升
G&VS10014.5C     活性液（Reagent C）                毫升
G&VS10014.5D    缓冲液（Reagent D）            毫升
G&VS10014.5E     反应液（Reagent E）                毫升
G&VS10014.5F     稳定液A（Reagent F1）            管
G&VS10014.5G     稳定液B（Reagent F2）            毫升
G&VS30030.1     Bradford蛋白质浓度定量试剂盒            100次

试剂盒订购信息
产品编号            名称            规格
G&VS10014.1    线粒体外膜功能检测试剂盒        20次
G&VS10014.2    纯化线粒体细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.3.1    细胞细胞细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.3.2    组织样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.4    纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.5    真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.6    植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次