细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒产品说明书

主要用途
细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氯荧光乙酰乙酸盐，在细胞氧化条件下，产生荧光，来定量检测细胞内活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。2',7'-二氯荧光乙酰乙酸盐（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一种完全自由通过细胞膜的染色剂。一旦被过氧化氢、过氧化基、过氧亚硝基阴离子等氧化，便产生荧光。据此测定细胞内活性氧族的浓度。

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
染色液（Reagent B）        微升
稀释液（Reagent C）        毫升
保存液（Reagent D）    毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（G&VS12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（G&VS12052）：用于细胞操作所需的培养基
15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器
1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器
血细胞计数仪：用于细胞计数
台式离心机：用于沉淀细胞
细胞流式仪：用于细胞荧光分析
（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光细胞
荧光分光光度仪或酶标仪：用于定量检测荧光细胞

实验步骤
一、间接法
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。
1．准备1瓶25cm2细胞培养瓶的待测细胞
2．小心抽去细胞培养液
3．加入xx毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面
4．小心抽去清理液（Reagent A）
5．加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
6．置入37℃培养箱1分种
7．振动培养瓶，使细胞脱落
8．加入4毫升用户自备的完全细胞培养液
9．移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）
10．移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
11．移出1 X 106细胞到新的15毫升锥形离心管
12．放入台式离心机离心5分钟，速度为300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液，轻柔混匀
15．放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照
16．放入台式离心机离心5分钟，速度为300g
17．小心抽去上清液
18．加入预冷的xx微升保存液（Reagent D），轻柔混匀细胞颗粒群
19．放进冰槽里
20．选择下列方式之一进行操作：
（A）即刻进行细胞流式仪分析：波长488nm氩离子激光，观察50000个细胞以上――
波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高
（B）或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：
1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片
2）激发波长490nm，散发波长530nm――
绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高
（C）或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：
1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色杯
2）加入xx微升保存液（Reagent D）
3）上下倾倒混匀数次
4）放进荧光分光光度仪：激发波长490nm，散发波长530nm――
RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

二、直接法
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。
1．准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70％
2．（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项4）
3．小心抽去细胞培养液
4．小心沿着孔壁加入xx微升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面
5．放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟
6．小心抽去染色工作液
7．小心沿着孔壁加入xx微升37℃预热的保存液（Reagent D）到细胞培养孔
8．选择下列方式之一进行操作：
（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：
激发波长490nm，散发波长530nm――绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高
（B）使用荧光酶标仪检测（定量检测）：
放进荧光分光光度仪：激发波长490nm，散发波长530nm――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事项
1．本产品为100次（24孔细胞培养板）或50次（1毫升规格）操作
2．操作时，须戴手套
3．孵育时，必须避免光照
4．本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整操作用量：
操作容器    操作用量
载玻片                100微升
载玻片培养皿      1毫升
35mm培养皿       1毫升
96孔培养板          100微升
48孔培养板          200微升
24孔培养板          500微升
12孔培养板          1毫升
6孔培养板            2毫升
25cm2细胞培养瓶    3毫升
5．建议细胞染色完成后，即刻进行细胞荧光分析
6．本公司提供阳性对照甲萘醌溶液（G&VS12041），观察细胞荧光增强现象
7．本公司同时提供细胞内活性氧高质荧光测定试剂盒（G&VS10016.1），满足不同用户需求
8．本公司提供系列活性氧分析试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号            名称                规格        
G&VS10016.2    细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒    100次
G&VS10016.2A    清理液（Reagent A）                毫升
G&VS10016.2B     染色液（Reagent B）                毫升
G&VS10016.2C     稀释液（Reagent C）                毫升
G&VS10016.2D     保存液（Reagent D）            毫升
G&VS12024    胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液            毫升
G&VS12041    甲萘醌溶液（1毫摩尔）            毫升
G&VS12024    DMEM完全细胞培养液            毫升

试剂盒订购信息
产品编号            名称                    规格
G&VS10016.1    细胞内氧化应激活性氧（ROS）高质绿色荧光测定试剂盒    20次
G&VS10016.2    细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒    100次
G&VS10016.3    活体组织氧化应激活性氧（ROS）高质绿色荧光测定试剂盒    8/20次
G&VS10016.4    活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒    40/100次
G&VS10016.5    冰冻切片氧化应激活性氧（ROS）高质绿色荧光测定试剂盒    50次
G&VS10016.6    冰冻切片氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒    50次
G&VS10016.7    真菌/酵母细胞内氧化应激活性氧（ROS）高质绿色荧光测定试剂盒    20次
G&VS10016.8    真菌/酵母细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒    50次
G&VS10016.9    植物细胞内氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒    20次
G&VS10016.10    植物细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒    50次
G&VS10016.11    体液氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒        50次
G&VS10016.12    体液氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒        50次