线粒体外膜功能检测试剂盒产品说明书

主要用途
线粒体外膜功能检测试剂是一种旨在通过细胞色素C氧化酶反应系统中，在去垢剂存在与否的条件下，还原性细胞色素C氧化后吸光峰值的变化，即采用比色法测定样品中酶活性，进而评价线粒体外膜功能完整性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体（动物、人体、植物、昆虫等）外膜功能完整性检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简捷，性能稳定。

技术背景
细胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase；COX；EC1.9.3.1）存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。作为线粒体外膜功能的生物标记，通过测定在去垢剂（既使COX酶保持活性，又使外膜充分裂解）存在与否的条件下，线粒体的酶含量变化，来衡量线粒体外膜的完整性。通常，在线粒体的制备过程中，由于受到物理或化学的处理，导致线粒体的损伤，有的甚至高达40％以上。

产品内容
缓冲液（Reagent A）     毫升
反应液（Reagent B）     毫升
稳定液A（Reagent C1）    管
稳定液B（Reagent C2）    微升
稀释液（Reagent D）    毫升
裂解液（Reagent E）        微升
产品说明书        1份

保存方式
缓冲液（Reagent A）和稀释液（Reagent D）保存在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent B）避免光照，有效保证6月

用户自备
1.5毫升离心管：用于反应液配制和样品处理的容器
比色皿：用于比色的容器
分光光度仪：用于比色分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的稳定液B（Reagent C2）置入冰槽里融化，然后移出xx微升到稳定液A（Reagent C1）管里，混匀后，标记为稳定工作液，置于冰槽里备用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent B）置入冰槽里融化，移出150微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稳定工作液，轻柔混匀后，室温下避光静置至少15分钟（可见颜色变化），置于冰槽里，标记为反应工作液（注意：参见注意事项5），放在暗室里。然后进行下列操作。

一、测读准备
1．设定好分光光度仪：温度25℃，波长550nm，间隔10秒，测读7次（共60秒），并置零或设置0秒和60秒各测读1次
2．从－70℃冰箱里取出待测的纯化线粒体样品，置于冰槽里融化
3．分别移出10微升待测样品（注意：总量4微克/10微升；参见注意事项16）到2个新的1.5毫升离心管，置入冰槽中（注意：参见注意事项4）
4．加入xx微升稀释液（Reagent D）到其中1管离心管（稀释液处理），混匀，即刻置入冰槽中
5．加入xx微升裂解液 （Reagent E）到另一管离心管（去垢液处理），混匀，即刻置入冰槽中（注意：参见注意事项16）
6．在冰槽中孵育15分钟，等待测定
7．缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

二、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的1毫升比色皿
2．加入xx微升稀释液（Reagent D）
3．放进分光光度仪，置零
4．取出比色皿，加入xx微升含有反应液（Reagent B）和稳定液（Reagent C）的反应工作液
5．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
6．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0秒读数－60秒读数）――

三、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2．加入xx微升稀释液（Reagent D）
3．加入10微升上述稀释液处理的待测样品
4．上下倾倒数次，混匀
5．放进分光光度仪，置零
6．取出比色皿，加入xx微升含有反应液（Reagent B）和稳定液（Reagent C）的反应工作液
7．即刻上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为稀释液处理样品读数（0秒读数－60秒读数）――此读数差值为正数，则表明样品具有酶活性
9．实际读数：（样品读数－背景读数）即损伤线粒体释放的细胞色素C氧化酶活性（COX）的实际读数
10．重复实验步骤1至9，测定上述裂解液处理的待测样品，此为总线粒体细胞色素C氧化酶活性（COX）的实际读数
四、线粒体外膜功能完整性评价-——外膜完整百分率

注意事项
1．本产品为50次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．线粒体样品中忌用DTT和巯基乙醇等处理
4．每个样品须一分为二处理后，然后进行测定
5．每增加1个样品，增加反应工作液为：反应液（Reagent B）100微升＋稳定工作液3微升，以此类推。配制反应工作液时，须根据样本数量配制实际工作液容量
6．系统操作过程中，背景测定只需1次
7．分光光度计波长严格设置在550nm，误差10nm将不产生信号
8．加样后3秒内进行比色测定
9．比色测定后，比色皿须清洗彻底
10．背景空对照0秒读数通常0.2至0.8为理想状态
11．背景空对照的正常读数差值（0秒－60秒）通常为0.001至0.005（正负即可）
12．样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致
13．样本测定60秒读数低于0秒读数（为负数）表明具有酶活性
14．如果测定样品中细胞色素C氧化酶（COX）单位活性，建议使用 纯化线粒体细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒－G&VS10014.2：
（样品读数－背景读数）÷[0.01（样品容量，毫升）X 21.84（毫摩尔吸光系数）]＝单位/毫升
15．细胞色素C氧化酶活性单位浓度定义：在25℃室温下，pH 7.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）氧化1微摩尔的细胞色素C
16．稀释液处理的线粒体样品为损伤线粒体释放的COX活性；裂解液处理的为总COX活性
17．建议待测样本线粒体蛋白浓度为2微克/10微升；如果样本酶活性过低或过高，即60秒读数不变或为零，则可以增加或降低样本量（本公司提供纯化线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒G&VS30034.1为后续的线粒体蛋白浓度测定的预处理试剂盒和纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒G&VS10059）
18．本公司提供系列细胞色素分析试剂产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号            名称            规格        
G&VS10014.1    线粒体外膜功能检测试剂盒        50次        
G&VS10014.1A    缓冲液（Reagent A）            毫升
G&VS10014.1B     反应液（Reagent B）            毫升
G&VS10014.1C     稳定液A（Reagent C1）        管
G&VS10014.1D     稳定液B（Reagent C2）        毫升
G&VS10014.1E     稀释液（Reagent D）        毫升
G&VS10014.1F    裂解液（Reagent E）            毫升
G&VS10059    纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒    20次
G&VS30034.1    纯化线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒    20次

试剂盒订购信息
产品编号            名称            规格
G&VS10014.1    线粒体外膜功能检测试剂盒        20次
G&VS10014.2    纯化线粒体细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.3.1    细胞样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.3.2    组织样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.4    纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.5    真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次
G&VS10014.6    植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒    20次