碱性蛋白酶（AKP）活性检测试剂盒说明书微量法

注意：正式测定前务必取 2-3  个预期差异较大的样本做预测定。
货号：JW-W-B302
规格：100T/48S

产品内容：
提取液：液体 55mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 4mL 蒸馏水溶解。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 4mL 提取液，沸水浴中磁力搅拌溶解。
试剂三：液体 20ml×1 瓶， 4℃保存。
试剂四：液体 4mL×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体 1mL×1 支，0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。

产品说明：
AKP 是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水 解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食 品、制革等行业。
在碱性条件下，AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨 蓝在 680nm有特征吸收峰，测定 680nm 吸光度增加速率，来计算 AKP 活性。
试验所需自备仪器和用品：
研钵、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴锅、磁力搅拌器、 可调式移液枪、1.5 mL EP 管和蒸馏水。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 提取液，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心 10min ，取上清液，即 粗酶液，置冰上待测。或直接称取 0. 1g 酶制品，加入 1mL 提取液，置冰上待测。

二、测定：
1. 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长到 680 nm ，蒸馏水调零。
2. 试剂一、试剂二和试剂三置于 40℃水浴保温 30min 以上。
3. 样本测定（在 1.5mLEP 管中依次加入下列试剂）
试剂名称(μL）    对照管    测定管    空白管    标准管
粗酶液        20    20        
试剂一        40            
试剂二            40        
混匀后 40℃水浴保温 10min        
试剂一            40        
试剂二        40            
混匀后 10000rpm 4℃离心 10min ，取上清        
上清        40    40        
蒸馏水                40    
标准品                    40
试剂三        200    200    200    200
试剂四        40    40    40    40
混匀后 40℃水浴保温 20min
取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 测定光吸收，分别记为 A 对照管、A 测定管、 A 空白管、A 标准管。

三、碱性蛋白酶活性计算：
（1） 按蛋白浓度计算
AKP 活性单位（U）定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生 1μmol 酪氨酸为一个酶活单位。
AKP 活性（U/mg prot）=C 标准品×（A 测定－A 对照） ÷（A 标准－A 空白） ×V1÷（Cpr×V2）
÷T=0. 125×（A 测定－A 对照） ÷（A 标准－A 空白） ÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
AKP 活性单位（U）定义：40℃每克样品每分钟催化水解产生 1μmol 酪氨酸为一个酶活单位。
AKP 活性（U/g）=C 标准品×（A 测定－A 对照） ÷（A 标准－A 空白） ×V1÷（W×V2÷V3） ÷T=0. 125×（A 测定－A 对照） ÷（A 标准－A 空白） ÷W
C 标准品：0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液； Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL）；W：样品质量  （g）；V1：酶促反应总体积（mL），0. 1mL； V2：加入反应体系中粗酶液体积（mL），2×10-2 mL； V3：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。
注意：若反应较弱，（A 测定管－A 对照管）差值较小，可适当延长反应时间（20-30min），即第一 步水浴时间，最后计算酶活时对公式进行修改。

本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！