抗坏血酸含量测定试剂盒说明书

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
货号：JW-W-A300
规格：100T/96S

产品内容：
提取液：液体120mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体6mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：液体6mL×1 瓶，4℃保存；
标准品：粉剂10mg×1 瓶（避光），4℃保存。（称取1mg加入10mL提取液，即为100μg/mL标准品）

试验中所需的仪器和试剂：
研钵、冰、低温离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

产品说明：
AsA 又称维生素c。AsA 是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂，AsA 在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻重的作用，也是衡量农作物产品品质的重要指标之一。
抗坏血酸具有较强还原能力将Fe3+还原成Fe2+，邻二氮菲与Fe2+会形成红色螯合物，在534nm处具有强的吸收法，且吸光值与反应液中抗坏血酸含量呈正比。

操作步骤：
一、样品的前处理：
(1)组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
(2)细菌、真菌：按照细胞数量（10个）：提取液体积（uL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；8000g，4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。
(3)血清等液体：按照样本体积（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1mL 样本，加入1mL提取液）进行混匀。8000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

二、测定操作表：
1.分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 534nm，提取液调零。
2.测定前将所有试剂 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min 以上。
3.标准曲线的绘制及样本测定（按顺序加入下列试剂）
        0μg/mL    15μg/mL    30μg/mL    60μg/mL    80μg/mL    100μg/mL    测定管
标准品（μL）    0    6    12    24    32    40    0
样本（μL）    0    0    0    0    0    0    40
提取液（μL）    40    34    28    16    8    0    0
试剂一（μL）    50    50    50    50    50    50    50
混合、摇匀
试剂二（μL）    25    25    25    25    25    25    25
试剂三（μL）    50    50    50    50    50    50    50
蒸馏水（μL）    50    50    50    50    50    50    50
充分混匀，室温静置 15min 后，534nm 处测定各管吸光值。如底部有沉淀，离心后再读数

三、抗坏血酸含量计算
根据标准曲线，将样品△A 带入公式中（x），计算出样品浓度 y（μg/mL）。
1.按蛋白浓度计算
抗坏血酸（μg / mg prot）=y×V 样÷（V 样×Cpr）
2.按样本鲜重计算
抗坏血酸（μg /g 鲜重）= y×V 样÷(V 样÷V 样总×W)
3.按细胞数量计算
抗坏血酸（μg /106cell）= y×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)
4.按体积计算
抗坏血酸（μg /mL）=10y
V 样总：上清液总体积，mL；V 样：加入反应体系中上清液体积；W：样品质量，g ；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；细胞数量：以 106 为单位计量；T：样本稀释倍数。

注意事项：
1、样品处理需匀浆完全，抗坏血酸易分解，需避光保存
2、标准品：现配现用。
3、若不确定样品中 抗坏血酸 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。
4、因为提取液中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。