CAT#:JW-15-74000
低温运输，-20℃保存

支原体通用探针法 qPCR 试剂盒

产品及特点    
支原体属（Mycoplasma spp.）是支原体目、支原体科的  1 属，有近百个种。它  们是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原  核细胞型微生物，大小为 0.1～0.3 微米。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。 支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病。但是它们常常污染培养细胞，污染发生  率高达到 50%左右，故培养细胞的支原体污染已经成为一个世界性的难题。由于当细  胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的 DNA、RNA 及蛋白表达发生改变， 而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，故难以察觉，因此在早期快速诊断具有重要  的意思。欧盟药典已经要求对使用培养细胞流程生产的生物工程制品进行 9 种支原体  的核酸检测。为此本公司开发了涵盖欧盟所要求的 9 种支原体检测试剂盒，它具有下  列特点：
1.   即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2.   引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。
3.   提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.   特异性高，引物是根据支原体通用DNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 DNA 发生交叉反应。
5.   能检测出至少  30 种最常见的支原体，其中包括欧盟所要求的 9 种，它们是莱氏  无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii）、发酵支原体（M.fermentans）、猪鼻  支原体（M. hyorhinis）、口腔支原体（M. oral）、精氨酸支原体（M. arginini）、 肺炎支原体（M. pneumonia）、鸡毒支原体（M. gallisepticum）、滑液支原体  （M. synoviae）和螺原体（Spiroplasma citri）。
6.   既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量 级。
7.   本产品足够 50 次20 μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
8.   本产品只能用于科研。

规格及成分    
本产品采用五孔盒包装
成分                编号        规格    包装    
2×Probe qPCR MasterMix        981201        0.5 mL    0.5 mL 本色盖    
荧光 PCR 专用模板稀释液        180701        1 mL    1.5 mL 绿盖管    
超纯水                210806        1 mL    1.5 mL 蓝盖管    
支原体通用 qPCR 引物-探针干粉        yp15-74000hx2    50 次    1.5 mL 棕色管    
支原体通用 qPCR 阳性 对照(1E7 拷贝/μL)    pc74170-NR-043199    50 μL    0.5 mL 黄盖管    
使用手册                15-74000sc    1份    无    
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入 165 μL 的超纯水充 分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为24 个月。
自备试剂：样品 DNA。

使用方法    一、稀释标准曲线样品（以 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准 品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试 剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品 做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.   标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、 1。
2.   用带芯枪头分别加入 45  μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.   在 6 号管中加入 5  μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟， 得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.   换枪头，在 5 号管中加入 5  μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.   换枪头，在 4 号管中加入 5  μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.   重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7.   如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10 μL 上步所得 4 号稀释液再加上一定  量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样， 以此作为 PC 。另  外用水作为 NC。
8.   用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品 DNA 提取试剂盒兼 容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、Probe qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
9.   如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品， 1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板） ，6 个用于标准曲 线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用 于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析 为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分            样品管 N+2 个    PCR 阴性对照    标准曲线样品管（1-6 管）
2×Probe qPCR MasterMix        各 10 μL        10 μL    各 10 μL
支原体通用 qPCR 引物-探针混合液    各 3 μL        3 μL    各 3 μL
N+2 个待测DNA 样本        各 7 μL        不加    不加
超纯水                不加        7 μL    不加

第 6 步所得标准曲线样品稀释液（1-6 号）    不加    不加    各 7 μL（2 号样到 2 号管 ，3号样到 3 号管…）
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程            温度    时间
预变性            94℃    5 min
PCR 反应（45 个循环）    95℃    15 sec
            55℃    30 sec（采集 FAM 通道的荧光 信号，设置 MGB 为淬灭基团）
四、数据处理
12. 如果样本制备阳性对照或 PCR 阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无  效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行 PCR 扩增或跟厂家联系。如果  样本制备阴性对照或 PCR 阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效， 不需要分析数据，需要跟厂家联系。
13. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵 轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无 Ct 或 Ct 大  于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 40， 否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无 Ct 或 Ct 大于或等于 40， 则为阴性。如果 Ct 小于 40 则为阳性。
关联产品：支原体通用可视化染料-荧光染料 LAMP 试剂盒