植物9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（NCED）酶联免疫分析试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：12 ng/L -420ng/L
使用目的：
本试剂盒用于测定植物样本中9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（NCED）含量。

实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物 9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（NCED） 水平。用纯化的植物 9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（NCED）抗体包被微孔板，制成固相 抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（NCED），再与 HRP  标记的 9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（NCED）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合 物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作 用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（NCED） 呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中植物 9-顺式环氧类胡萝 卜素双加氧酶（NCED）浓度。

试剂盒组成
1    30 倍浓缩洗涤液    20ml×1 瓶    
2    酶标试剂        6ml×1 瓶    
3    酶标包被板    12 孔×8 条    
4    样品稀释液    6ml×1 瓶    
5    显色剂 A 液    6ml×1 瓶    
6    显色剂 B 液    6ml×1/瓶    
7    终止液        6ml×1 瓶
8    标准品（800ng/L）    0.5ml×1 瓶
9    标准品稀释液    1.5ml×1 瓶
10    说明书        1 份
11    封板膜        2 张
12    密封袋        1 个

标本要求
1 ．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能 马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤
1.     标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。
400ng/L    5 号标准品    150μl 的原倍标准品加入 150μl 标准品稀释液
200ng/L    4 号标准品    150μl 的 5 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
100ng/L    3 号标准品    150μl 的 4 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
50ng/L    2 号标准品    150μl 的 3 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
25ng/L    1 号标准品    150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
2.     加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50μl，待测样品孔中先加样品稀释液 40μl， 然后再加待测样品 10μl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.     温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
4.     配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用
5.     洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。
6.     加酶：每孔加入酶标试剂 50μl ，空白孔除外。
7.     温育：操作同 3。
8.     洗涤：操作同 5。
9.     显色：每孔先加入显色剂 A50μl ，再加入显色剂 B50μl ，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10 分钟.
10.   终止：每孔加终止液 50μl ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.   测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。

操作程序总结：

计算
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓度。

注意事项
1 ．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。
2 ．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3 ．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4 ． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值 大于标准品孔第一孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数 ( ×n×5）。
5 ． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6 ．底物请避光保存。
7 ．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8 ．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9 ．本试剂不同批号组分不得混用。

保存条件及有效期
1 ．试剂盒保存：；2-8℃。
2 ．有效期：6 个月