CAT#：JW-220542
常温运输，有 3 个低温成分

His 标记蛋白质微量纯化试剂盒

产品及特点    
基于组氨酸-镍（His-Ni）亲和层析的蛋白质纯化方法是目前分离纯化重组表 达蛋白质的重要方法，本产品就是专门用于上述实验的一站式产品，具有下列特 点：
1.  一站式套装，含所需的镍柱介质、上柱液、洗柱溶液和层析柱，用户只需要 提供表达 His 蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。
2.  一次过柱即可获得纯度高达 95%的 His-标记蛋白。
3.  可在变性和非变性条件使用。
4.  每次可以处理 20 mL 的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。
5.  提供 4 mL 浓度为 50%的 Ni-Agarose 介质，其最大载量为 20-30 mg His 标记蛋白质/mL 介质。本介质可以反复使用。
6.  本产品只能科研使用。
规格及成分    
本产品采用小扁盒盒包装
成份            编号    规格    包装    
镍柱介质，50%        220542    4 mL    5 mL 本色瓶    
1 M 咪唑溶        220542a    25 mL    30 mL 本色瓶    
1 M Tris-HCl 溶液，pH 7.9    220542b    25 mL    30 mL 本色瓶    
5 M NaCl 溶液        220542c    25 mL    30 mL 本色瓶    
溶菌酶+核酸酶（3： 1： 1）    220542d    50 mg    0.5 mL 红盖管    
盐酸胍干粉        50-01-1    6 g    10 mL 本色瓶    
尿素干粉            57-13-6    20 g    30 mL 本色瓶    
PMSF 溶液（10 mg/mL）    100833    0.5 mL    0.5 mL 白盖管    
亲和层析柱，6 mL        110809    1套    塑料袋    
使用手册            220542sc    1份    无    
    
运输及保存：常温运输和保存，但镍柱介质长期需 4℃保存，溶菌酶+核酸酶和 PMSF 溶液需
-20℃保存，有效期一年
自备试剂：去离子水、20%乙醇、针头过滤器（0.45 μm）

使用方法    
1.  将镍柱介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（镍柱介 质用量需要根据 His 蛋白产量决定，其最大载量为20-30 mg His 标记蛋白 质/mL 介质，请根据实验需要取适量的镍柱介质加入层析柱）。
2.  用 5 倍柱体积（指镍柱介质的体积，下同）自备去离子水洗柱，共三次。
3.  用 5 倍柱体积的新配结合液洗柱（配方如下， 以 10 mL 为例）， 共三次：
成分            用量    在结合缓冲液中的浓度    
1 M Tri-HCl（pH 7.9）    0.2 mL    20 mM    
1 M 咪唑溶液        0.1 mL    10 mM    
5 M NaCl 溶液        1 mL    500 mM    
自备去离子水        8.7 mL    -    
4.  室温 5000×g 离心 10 分钟收集 20 mL 表达菌液，弃上清，沉淀（约 100 mg） 放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照样。
5.  如果超声破碎细菌：加入 1 mL 冰浴的结合液（1 mL 菌液需要用 50 μL 结 合液），再加入 25 μL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到 在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但 裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。如果酶法裂解细菌：加入 1 mL 冰 浴的含溶菌酶的结合液（先取 20 mL 结合液，加入所有 50 mg 溶菌酶-核酸 酶干粉，溶解后分装成 1 mL/管，剩余的-20℃放置），再加入 25 μL PMSF （10 mg/mL）溶液，冰上放置 30 分钟。
6.  4℃下 13000-15000×g 离心 10 分钟，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱， 收集上清， 留样做 SDS-PAGE 电泳对照。如果要纯化裂解液中可溶部分的  His 标记蛋白，则直接进入第 7 步；如果要纯化裂解液中包涵体（沉淀部分） 中的 His 标记蛋白，则直接进入第 12 步。
A、纯化细胞裂解液中可溶部分的 His 标记蛋白
7.  将上步得到的上清液上柱，让重力使裂解液自然流出。如要提高 His 标记蛋 白与介质的结合效率，可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让 细菌裂解液和介质在 4℃结合 30 分钟或过夜。
8.  用 10 倍柱体积结合液洗柱（配方见上表）， 收集并保存穿透液（含杂质或没 被吸附的 His 标记蛋白，可做 SDS-PAGE 电泳的对照）。
9.  如果用一步式洗脱法（适合已经找到最佳咪唑浓度的情况），则直接用适量的 新鲜配制的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含 His 标记蛋白）。洗脱液的配 方如下（以 1 mL 体积和最佳咪唑浓度是 500 mM 为例）：
成分            用量    在洗脱液中的浓度    
1 M Tri-HCl （pH 7.9）    20 μL    20 mM    
1 M 咪唑溶液        500 μL    500 mM    
5 M NaCl 溶液        100 μL    500 mM    
自备去离子水        380 μL    -    
10. 如果用多步式洗脱（适合不知道最佳咪唑浓度或一步式洗脱杂质多的情况），  则按上表配制一系列咪唑浓度不同（如 40、60、100、200、300 和 500 mM）， 其他成分浓度不变的洗液，按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE  电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。
11. 洗脱后，依次使用 10 倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用 3 倍柱体积的20% 乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），最后堵住层析柱下端的漏口， 4℃保存待下 次使用。
B、纯化包涵体中 His 标记蛋白
12. 将第 6 步离心得到的包涵体沉淀重悬于 1-3 mL 含盐酸胍结合液中或 1-3 mL 含尿素结合液中（建议优先使用尿素做变性剂， 因为得到的洗脱液可以直接 跑 SDS-PAGE，而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳）。冰浴 1 小时以 使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下（以 10 mL 为例）：
成分            含盐酸胍结合液    含尿素结合液
1 M Tri-HCl（pH 7.9）    200 μL        200 μL
5 M NaCl 溶液        1 mL        1 mL
盐酸胍（MW=95.6）        5.7 g        无
尿素（MW=60.1）        无        4.8 g
自备去离子水        加水到 10 mL    加水到 10 mL
13. 室温 10000×g 离心 20 分钟，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后 的 His 标记蛋白） 以自备的针头过滤器（0.45 μm）过滤。
14. 将滤过液上柱，后续纯化步骤同第 7-第 11 步。只是所用结合液和洗脱液均 含变性剂，含变性剂的洗脱液配方见下表（以 1 mL 为例）：
成分            含盐酸胍洗脱液    含尿素洗脱液    
1 M Tri-HCl（pH 7.9）    20 μL        20 μL    
1 M 咪唑溶液        500 μL        500 μL    
5 M NaCl 溶液        100 μL        100 μL    
盐酸胍（MW=95.6）        0.57 g        无    
尿素（MW=60.1）        无        0.48 g    
自备去离子水        补水到 1 mL    补水到 1 mL    
注意事项：整个实验需避免含巯基乙醇、DTT 和 EDTA 等成分。若洗脱液不能将 His 标记 蛋白洗脱下来，可改用 pH 6.5-4.5 的 pH 递减的 Tris-HCl 洗脱。