细胞脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
细胞脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用脯氨酸羟化酶、琥珀酸辅酶A合成酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中脯氨酸羟化酶总活性的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景
脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase；PHD；EC1.14.11.2），又称为原胶原-脯氨酸-酮戊二酸-4-加双氧酶（procollagen-proline-2-oxo-glutarate 4-dioxygenase），属于双加氧酶超级家族中酮戊二酸依赖性非血红素亚铁双加氧酶成员，为四聚体蛋白，具有蛋白质侧链修饰、表观遗传学调节、烷基化DNA/RNA修复、氧气感应、脂类代谢、代谢产物合成或降解等作用。脯氨酸羟化酶催化原胶原蛋白分子中2S脯氨酸残基的转译后羟基化，产生2S 4R-4-羟脯氨酸残基，使胶原蛋白三螺旋结构折叠、分泌和稳定。脯氨酸羟化酶需要亚铁离子、酮戊二酸、分子氧等。脯氨酸羟化酶有3个同工酶：PHD1、PHD2和PHD3。PHD1和PHD3为结构型活化。PHD3主要调节HIF-2α。PHD2在缺氧时高调，作用于胚胎发育、氧气内平衡、HIF-1α水平调节等，一旦突变或缺失，会导致红细胞增多症、胰腺肿瘤转移等。脯氨酸羟化酶是贫血、缺血和代谢疾病的药物靶标。基于底物脯氨酸，受到脯氨酸羟化酶的催化，同时分解2-酮戊二酸，产生羟脯氨酸和琥珀酸，进而通过琥珀酸辅酶A合成酶（Succinyl CoA synthetase）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），所产生的峰值变化（340nm），来定量分析脯氨酸羟化酶的总活性。其反应系统为：
 
产品内容
清理液（Reagent A）     毫升
裂解液（Reagent B）     毫升
缓冲液（Reagent C）     毫升
酶促液（Reagent D）     微升
反应液（Reagent E）     毫升
底物液（Reagent F）        毫升
阴性液（Reagent G）    毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；缓冲液（Reagent C）室温下预热。然后进行下列操作。

一、样品准备
1．准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备
1．准备好上述待测样品，置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零
3．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升反应液（Reagent E）
4．加入xx微升底物液（Reagent F）
5．放进37℃培养箱里静置3分钟
6．加入xx微升阴性液（Reagent G）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

四、样品活性测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升反应液（Reagent E）
4．加入xx微升底物液（Reagent F）
5．放进37℃培养箱里静置3分钟
6．加入50微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟
 
五、计算样品活性

注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5．样品须澄清，至关重要
6．加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
7．反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟
8．测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于30分钟测定读数，表明有酶活性
9．光度测定后，比色皿须清洗彻底
10．建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒G&VS30030.1）
11．脯氨酸羟化酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.8条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列脯氨酸羟化酶检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测准确

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                            规格        
G&VS50465.1    细胞脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒    20次        
G&VS50465.1A    清理液（Reagent A）                           毫升
G&VS50465.1B     裂解液（Reagent B）                            毫升
G&VS50465.1C    缓冲液（Reagent C）                           毫升
G&VS50465.1D     酶促液（Reagent D）                    毫升
G&VS50465.1E     反应液（Reagent E）                            毫升
G&VS50465.1F     底物液（Reagent F）                            毫升
G&VS50465.1G    阴性液（Reagent G）                    毫升
G&VS30030.1    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒                    200次
 
试剂盒订购信息
产品编号        名称                            规格
G&VS50465.1    细胞脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒    20次
G&VS50465.2    组织脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒    20次
G&VS50465.3    体液脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒    20次
G&VS50465.4    植物脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒    20次
G&VS50466.1    细胞赖氨酸羟化酶（lysyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒        20次
G&VS50466.2    组织赖氨酸羟化酶（lysyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒        20次
G&VS50466.3    体液赖氨酸羟化酶（lysyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒        20次
G&VS50466.4    植物赖氨酸羟化酶（lysyl hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒        20次
G&VS50467    脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase）活性高效液相色谱定量检测试剂盒    20次
G&VS50468    赖氨酸羟化酶（lysyl hydroxylase）活性高效液相色谱定量检测试剂盒    20次