植物腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
植物腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂是一种旨在通过腺苷酸激酶、己糖激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶的酶连续循环反应系统下，伴随的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）还原反应后峰值的变化，即采用光度法来测定植物组织裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等腺苷酸激酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
腺苷酸激酶（Adenylate kinase；ADK；EC2.7.4.3），又称为肌激酶（myokinase）或ATP：AMP磷酸转移酶（ATP：AMP phosphotransferase），是一种磷酸转移酶（phosphotransferase），催化腺嘌呤核苷酸的相互转换的反应。哺乳动物腺苷酸激酶由3个同工酶：I型（ADK1）为细胞质型；II型（ADK2）为线粒体型；III型为GTP：AMP磷酸转移酶（GTP：AMP phosphotransferase），也位于线粒体。此外酵母细胞的腺苷酸激酶是鸟苷单磷酸激酶（uridine monophosphokinase）和黏液菌（slime mold）的鸟苷-胞苷单磷酸激酶（UMP-CMP kinase）。植物的腺苷酸激酶有6个同工酶，叶绿体含有3种，线粒体含有1种，胞浆或胞核含有2种。其中40至90%的活性在叶绿体内，而线粒体和胞浆几乎没有或很低。其功能在于维护细胞能量的内在平衡、控制细胞生长速率、光照分配变化等。基于底物腺苷二磷酸（adenine diphosphate；ADP），在腺苷酸激酶的作用下，产生腺苷三磷酸（ATP），进而通过己糖激酶（hexokinase）和葡萄糖6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase；G6PDH）反应系统中，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized  nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH），其峰值的变化（340nm），来定量分析腺苷酸激酶的总活性。其反应方式为：

Adenylate kinase
2ADP   +  H2O   →   AMP   +  ATP

hexokinase
D-glucose   +  ATP   →   D-glucose 6-phosphate   +  ADP

Glucose 6-phosphate dehydrogenase
glucose 6-phosphate  +  NADP   →   6-phosphogluconate  +  NADPH

产品内容
清理液（Reagent A）     60毫升
裂解液（Reagent B）     10毫升
缓冲液（Reagent C）     20毫升
反应液（Reagent D）     2毫升
底物液（Reagent E）        2毫升
阴性液（Reagent F）        1毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
DOUNCE匀浆器：用于组织匀化
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于光度分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
1．准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定500毫克组织重量
2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．即刻用刀片切碎组织
5．放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6．加入预冷的1毫升裂解液（Reagent B）
7．涡旋震荡5秒，充分混匀
8．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）
9．将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为300g
10．小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
11．（选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为300g
12．即刻移入到1.5毫升离心管
13．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
14．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；缓冲液（Reagent C）室温下预热均衡；底物液（Reagent E）避免光照

三、背景对照测定
1．移取780微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入100微升反应液（Reagent D）
3．加入100微升底物液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在37℃温度下孵育3分钟
6．加入20微升阴性液（Reagent F）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（5分钟读数－0分钟读数）

四、样品测定
1．移取780微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入100微升反应液（Reagent D）
3．加入100微升底物液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在37℃温度下孵育3分钟
6．加入20微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数）

五、计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.02（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADPH/分钟

六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取195微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
3．分别加入25微升反应液（Reagent D）
4．分别加入25微升底物液（Reagent E）
5．在37℃温度下孵育3分钟
6．分别加入5微升阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
7．轻轻摇动96孔板
8．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
9．活性计算
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADPH/分钟

注意事项
1．本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．建议使用比色皿测定
5．样品须澄清，至关重要
6．加样后3秒内光度测定
7．测定值由低到高变化；测定可持续5分钟
8．光度测定后，比色皿须清洗彻底
9．样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为50微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．腺苷酸激酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.6条件下，每分钟内能够产生1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）所需的酶量作为一个活性单位
13．本公司提供系列经典细胞激酶检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                        规格        
G&VS50498.3    植物腺苷酸激酶活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒    20次    
G&VS50498.3A    清理液（Reagent A）                    100毫升
G&VS50498.3B     裂解液（Reagent B）                     100毫升
G&VS50498.3C    缓冲液（Reagent C）                    100毫升
G&VS50498.3D     反应液（Reagent D）                10毫升
G&VS50498.3E     底物液（Reagent E）                    10毫升
G&VS50498.3F     阴性液（Reagent F）                    1毫升
G&VS30030.1    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒                 200次

试剂盒订购信息
产品编号        名称                                规格
G&VS50498.1    细胞腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒    20次
G&VS50498.2    组织腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒    20次
G&VS50498.3    植物腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒    20次
G&VS50498.4    真菌/酵母腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒    20次
G&VS50498.5    细菌腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂盒    20次