细胞染色质免疫沉淀分析试剂盒产品说明书

主要用途
细胞染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂是一种旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，来确定结合蛋白的目标DNA序列的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于DNA复制、重组、修复、转录、病毒组装中的DNA和蛋白质（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的相互作用的研究。广泛应用于定性检测各种动物细胞DNA蛋白结合序列和定量检测序列特异性DNA结合蛋白（例如转录因子）及其突变形成等。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，反应敏感，结合显著，重复性好。

技术背景
DNA和蛋白质的相互作用是调控细胞反应过程的要素之一。染色质免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活体内（in vivo）DNA和蛋白质的相互作用的最新最有力的工具：用于分析染色质结构动力学、转录因子调节、以及表观遗传学变异等。CHIP技术通过三大步骤实现：第一，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白之抗体，免疫共沉淀结合蛋白（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的染色质片断；第三，分析目标DNA和蛋白的修饰。其中转录因子作为调节蛋白，通过结合核DNA，以达到控制基因表达。
 
产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
固着液（Reagent B）        毫升
终止液（Reagent C）        毫升
裂解液（Reagent D）     毫升
核溶液（Reagent E）        毫升
稀释液（Reagent F）        毫升
结合液（Reagent G）    毫升
低盐液（Reagent H）    毫升
高盐液（Reagent I）        毫升
平衡液（Reagent J）        毫升
缓冲液（Reagent K）        毫升
洗脱液（Reagent L）        毫升
解联液（Reagent M）     毫升
酶解液（Reagent N）    微升
萃取液（Reagent O）     毫升
浓缩液（Reagent P）        毫升
沉淀液（Reagent Q）    毫升
净化液（Reagent R）        毫升
扩增液（Reagent S）        微升
补充液（Reagent T）        1毫升
产品说明书          1份

保存方式
保存裂解液（Reagent D）、核溶液（Reagent E）、稀释液（Reagent F）、结合液（Reagent G）、解联液（Reagent M）、酶解液（Reagent N）、萃取液（Reagent O）、浓缩液（Reagent P）和扩增液（Reagent S）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 有效保证6月

用户自备
特异抗体：用于目标蛋白的结合
特异引物：用于目标DNA的扩增或测序
1.5毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器
2毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于脱离细胞
恒温水槽：用于孵育反应物
震荡器：用于混匀反应物
4℃微型台式离心机：用于沉淀样品
4℃台式离心机：用于沉淀样品
平式摇荡仪或摇床：用于孵育和混匀反应
DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞
超声仪：用于裂解组织细胞核
PCR仪：用于扩增反应
电泳仪：用于检测扩增产物

实验步骤
实验开始前，准备好待测细胞的预处理：药物处理等。同时将－20℃保存的试剂置于冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、细胞核分离
（一）贴壁细胞核分离
1．准备100mm细胞培养皿或75cm2细胞培养瓶的细胞，直至生长到80至90％铺满率（1 X 107细胞）
2．小心抽去上清液
3．（选择步骤）小心加入xx毫升清理液（Reagent A），铺满生长表面
4．（选择步骤）小心抽去清理液（Reagent A）
5．加入xx毫升室温预热的固着液（Reagent B）
6．置于摇床，室温下（25℃）孵育15分钟，速度为50RPM
7．加入xx毫升室温预热的终止液（Reagent C）
8．继续置于摇床，室温下（25℃）孵育5分钟，速度为50RPM
9．小心抽去含有终止液（Reagent C）的固着液（Reagent B）
10．小心加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），铺满生长表面
11．小心抽去清理液（Reagent A）
12．即刻用细胞刮脱棒刮脱细胞
13．转移到15毫升锥形离心管
14．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
15．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
16．小心抽去上清液
17．重复实验步骤14至16一次
18．加入xx毫升预冷的裂解液（Reagent D），混匀
19．涡旋震荡5秒，充分混匀
20．置于冰槽里孵育10分钟
21．（选择步骤）即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
22．（选择步骤）在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约5下）（注意：参见注意事项7）
23．（选择步骤）将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
24．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
25．小心抽去上清液
26．加入xx毫升核溶液（Reagent E），混匀颗粒群
27．置于冰槽里孵育10分钟
28．置于200瓦超声仪下，功率50％，猝击20秒，间隙10秒冷却，重复3次（注意：根据DNA片段大小，增加超声次数）
29．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
30．小心移取上清液分装到10个2毫升离心管（100微升/管）
31．其中： 1）选择1管进行1：50稀释后，测定OD260，确定DNA含量，使所有样品的检测浓度调整一致（注意：建议OD260＝0.1为佳）
2）或选择1管进行蛋白浓度检测，使所有样品的检测浓度调整一致（注意：蛋白总量1至5毫克为佳；建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
3）或选择1管进行去交联以及电泳鉴定超声处理的DNA片段（0.3至1.5kb）（注意：参见注意事项8）
32．选择1管继续后续操作，其余的保存在－70℃冰箱里
33．加入xx微升稀释液（Reagent F）
34．进入实验步骤二继续

（二）悬浮细胞核分离
1．准备75cm2细胞培养瓶的悬浮细胞（1 X 107细胞）
2．转移到50毫升锥形离心管
3．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
4．小心抽去上清液
5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀
6．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
7．小心抽去上清液
8．加入xx毫升室温预热的固着液（Reagent B），混匀
9．平放置于摇床，室温下（25℃）孵育15分钟，速度为100RPM
10．加入xx微升室温预热的终止液（Reagent C）
11．继续平放置于摇床，室温下（25℃）孵育5分钟，速度为100RPM
12．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
13．小心抽去上清液
14．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
15．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
16．小心抽去上清液
17．重复实验步骤14至16二次
18．加入xx毫升预冷的裂解液（Reagent D），混匀
19．涡旋震荡5秒，充分混匀
20．置于冰槽里孵育10分钟
21．（选择步骤）即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
22．（选择步骤）在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约5下）（注意：参见注意事项7）
23．（选择步骤）将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
24．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
25．小心抽去上清液
26．加入xx毫升核溶液（Reagent E），混匀颗粒群
27．置于冰槽里孵育10分钟
28．置于200瓦超声仪下，功率50％，猝击20秒，间隙10秒冷却，重复3次（注意：根据DNA片段大小，增加超声次数）
29．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
30．小心移取上清液分装到10个2毫升离心管（100微升/管）
31．其中：
1）选择1管进行1：50稀释后，测定OD260，确定DNA含量，使所有样品的检测浓度调整一致（注意：建议OD260＝0.1为佳）
2）或选择1管进行蛋白浓度检测，使所有样品的检测浓度调整一致（注意：蛋白总量1至5毫克为佳；建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
3）或选择1管进行去交联以及电泳鉴定超声处理的DNA片段（0.3至1.5kb）（注意：参见注意事项8）
32．选择1管继续后续操作，其余的保存在－70℃冰箱里
33．加入xx微升稀释液（Reagent F）
34．进入实验步骤二继续

二、结合反应
1．加入xx微升结合液（Reagent G）（注意：可以增加结合液（Reagent G），以获得更多的DNA片段，但避免非特异性增加）
2．平放置于4℃摇床孵育1小时，速度为100RPM
3．放进4℃台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
4．小心移取上清液到2个新的2毫升离心管（每管500微升：1管为无抗体对照；1管为抗体处理管）
5．加入50微升用户自备的特异抗体（总量为5微克）到抗体处理管（注意：可以增加特异抗体总量，以获得更多的DNA片段，但避免非特异性增加）
6．将对照和抗体管平放置于4℃摇床孵育16小时，速度为100RPM
7．加入xx微升结合液（Reagent G）到抗体处理管
8．将对照和抗体管平放置于4℃摇床孵育2小时，速度为100RPM
9．将抗体管放进4℃台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
10．小心抽去上清液
11．加入xx毫升低盐液（Reagent H）到抗体管，混匀
12．平放置于4℃摇床孵育5分钟，速度为100RPM
13．放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心抽去上清液
15．加入xx毫升高盐液（Reagent I）到抗体管，混匀
16．平放置于4℃摇床孵育5分钟，速度为100RPM
17．放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
18．小心抽去上清液
19．加入xx毫升平衡液（Reagent J）到抗体管，混匀
20．平放置于4℃摇床孵育5分钟，速度为100RPM
21．放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
22．小心抽去上清液
23．加入xx毫升缓冲液（Reagent K）到抗体管，混匀
24．平放置于4℃摇床孵育5分钟，速度为100RPM
25．放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
26．小心抽去上清液
27．重复实验步骤23至26一次
28．加入xx微升洗脱液（Reagent L）到抗体管，混匀（注意：如果洗脱液（Reagent L）为乳白色，使用前，须温育至澄清，才可使用）
29．平放置于摇床，室温下孵育15分钟，速度为100RPM
30．放进4℃微型台式离心机离心3分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
31．小心移取上清液到新的2毫升离心管
32．重复实验步骤28至31一次
33．小心移取上清液合并到上述2毫升离心管（注意：可以暂时停止，存放在－20℃，次日继续）

三、DNA萃取
1．分别加入xx微升解联液（Reagent M）到抗体处理管和无抗体对照管，混匀
2．置于65℃恒温水槽孵育2小时（注意：必要时可以继续4度过夜）
3．分别加入xx微升酶解液（Reagent N）
4．置于55℃恒温水槽孵育2小时
5．室温下静置15分钟
6．分别加入xx微升萃取液（Reagent O）（注意：使用前摇匀）
7．涡旋震荡15秒
8．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
9．分别移出450微升上层液相溶液到2个新的2毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
10．分别加入xx微升浓缩液（Reagent P）到新的离心管
11．分别加入xx毫升沉淀液（Reagent Q）
12．涡旋震荡15秒
13．放进微型台式微型离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
14．小心抽掉上清液
15．分别加入xx毫升净化液（Reagent R）
16．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
17．小心抽掉上清液
18．空气中晾干沉淀颗粒群
19．分别加入xx微升缓冲液（Reagent K）
20．溶解后放进－20℃冰箱保存

四、PCR扩增
1．将扩增液（Reagent S）和补充液（Reagent T）从－20℃冰箱里取出
2．置入冰槽里直至融化
3．针对一个样本，每次移出xx微升扩增液（Reagent S）到PCR管
4．加入2微升上述结合实验中获得的DNA样品（总量100纳克）
5．分别加入1微升用户自备的特异性的引物F和引物R（各350纳克或25微摩尔）
6．再加入xx微升补充液（Reagent T）（反应总量为25微升）
7．即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒，速度为500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
8．加入50微升PCR级矿物油（注意：参见注意事项9）
9．即刻进行热启动PCR反应：

温度（℃）    时间        循环
95        2分钟        1
95        30秒
Tm        1分钟        35
72        30秒                        
72        5分钟        1

10．反应完毕后，移取5微升进行1.5%琼脂糖凝胶电泳
11．如果进行测序鉴定，胶回收PCR产物（建议使用高质纯化一步法胶回收试剂盒；G&VS20051.1）
12．分别移出2微升反应液到2个不同的新的1.5毫升离心管（每微升100纳克）
13．加入1微升用户自备的特异性巢式引物F（每微升350纳克）到其中一个1.5毫升离心管，作好标记
14．加入1微升用户自备的特异性巢式引物R（每微升350纳克）到另一个1.5毫升离心管，作好标记
15．进行后续的直接测序反应

注意事项
1．本产品为10次（1 X 107细胞/次）操作
2．操作时，须戴手套
3．固着处理必须在室温下进行，其余的操作均须在4℃状态进行
4．严格按照操作规程进行
5．建议使用无抗体对照
6．用户可以使用Histone H3（trimethyl K4）抗体作为阳性对照；GFP抗体作为阴性对照
7．如果使用胰酶脱离贴壁细胞，脱离后按照悬浮细胞核分离步骤操作
8．通常匀化次数为5下达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
9．通常超声处理后的DNA片段大小为0.3至1.5kb；如果使片段小于1.0kb，增加超声次数或功率即可。电泳鉴定前，加入10微升解联液（Reagent M）到1管100微升超声处理后样品，65℃孵育4小时，移取20微升进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。其标准片段电泳图象如下：泳道1为DNA标准样；泳道2为未经超声处理样品；泳道3为超声处理后样品；泳道4为强化超声处理后样品
10．根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）
11．建议使用软件测算Tm温度；参考公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）
12．在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
13．本公司提供系列CHIP研究产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                规格        
G&VS30075.1    细胞染色质免疫沉淀分析试剂盒        10次
G&VS30075.1A    清理液（Reagent A）            毫升
G&VS30075.1B    固着液（Reagent B）            毫升
G&VS30075.1C    终止液（Reagent C）            毫升
G&VS30075.1D    裂解液（Reagent D）         毫升
G&VS30075.1E    核溶液（Reagent E）            毫升
G&VS30075.1F    稀释液（Reagent F）            毫升
G&VS30075.1G    结合液（Reagent G）        毫升
G&VS30075.1H    低盐液（Reagent H）        毫升
G&VS30075.1I    高盐液（Reagent I）            毫升
G&VS30075.1J    平衡液（Reagent J）            毫升
G&VS30075.1K    缓冲液（Reagent K）            毫升
G&VS30075.1L    洗脱液（Reagent L）            毫升
G&VS30075.1M    解联液（Reagent M）         毫升
G&VS30075.1N    酶解液（Reagent N）        毫升
G&VS30075.1O    萃取液（Reagent O）         毫升
G&VS30075.1P    浓缩液（Reagent P）            毫升
G&VS30075.1Q    沉淀液（Reagent Q）        毫升
G&VS30075.1R    净化液（Reagent R）            毫升
G&VS30075.1S    扩增液（Reagent S）            微升
G&VS30075.1T    补充液（Reagent T）            毫升
G&VS30030.1    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒         200次

试剂盒订购信息
产品编号        名称                        规格
G&VS30075.1    细胞染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒            10次
G&VS30075.2    细胞染色质免疫沉淀分析（CHIP）完全试剂盒（包括抗体）    10次
G&VS30076.1    组织染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒            10次
G&VS30076.2    组织染色质免疫沉淀分析（CHIP）完全试剂盒（包括抗体）    10次
G&VS60076.1    真菌/酵母细胞染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒        10次
G&VS60076.2    真菌/酵母细胞染色质免疫沉淀分析（CHIP）完全试剂盒（包括抗体）    10次
G&VS30077.1    细胞甲基化组蛋白H3-K9染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒    10次
G&VS30077.2    组织甲基化组蛋白H3-K9染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒    10次
G&VS30078.1    细胞甲基化组蛋白H3-K4染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒    10次
G&VS30078.2    组织甲基化组蛋白H3-K4染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒    10次
G&VS30079.1    细胞乙酰化组蛋白H3染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒    10次
G&VS30079.2    组织乙酰化组蛋白H3染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒    10次
G&VS30080.1    细胞乙酰化组蛋白H4染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒    10次
G&VS30080.2    组织乙酰化组蛋白H4染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒    10次
G&VS16013.1    植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒            10次
G&VS16013.2    植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）完全试剂盒（包括抗体）    10次
G&VS20117.1    通用型CHIP DNA分子克隆试剂盒                10次
G&VS20117.2    通用型CHIP DNA分子库构建试剂盒            10次
G&VS20118.1    高效CHIP DNA分子克隆试剂盒                10次
G&VS20118.2    高效CHIP DNA分子库构建试剂盒                10次