本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断
植物（Plant）活性氧簇（ROS）检测试剂盒使用说明书

检测原理
试剂盒采用双抗体 一 步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预  先包被活性氧簇（ROS）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、 HRP标记的检测抗体， 经过温育并彻底洗涤。 用底物TMB显色，TMB  在过氧化物酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的  黄色。颜色的深浅和样品中的活性氧簇（ROS）呈正相关。 用酶标仪
在450nm  波长下测定吸光度（OD  值）， 计算样品浓度。

样品收集 、 处理及保存方法
1.样本不能含叠氮钠（NaN3）， 因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2.标本采集后尽早进行提取， 提取按相关文献进行。
3.植物萃取液或其它相关样本： 请1000 x g离心20分钟， 取上清即可检测。
4.保存： 如果样本收集后不及时检测，请按 一 次用量分装 ，冻存于-20℃ ,   避免反复冻融， 在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱

操作注意事项
1. 试剂盒保存在 2-8℃ ,    使用前室温平衡 20  分钟 。 从冰箱取出的 浓缩洗涤液会有结晶， 这属于正常现象， 水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为 0  的 S0  号标准品即可视为阴性对照或者空白； 按照说明书操作时样本已经稀释 5 倍， 最终结果乘以 5 才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间 、 加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成
名称        96孔配置        48孔配置        备注
微孔酶标板    12孔×8条        12孔×4条        无
标准品        0.3mL *6 管    0.3mL *6 管    无
样本稀释液    6mL        3mL        无
检测抗体-HRP    10mL        5mL        无
20×洗涤缓冲液    25mL        15mL        按说明书进行稀释
底物 A        6mL        3mL        无
底物 B        6mL        3mL        无
终止液        6mL        3mL        无
封板膜        2 张        2 张        无
说明书        1 份        1 份        无
自封袋        1 个        1 个        无
注： 标准品（S0-S5） 浓度依次为 ：0 、 10 、20 、40 、80 、 160 pg/mL

试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释 ：蒸馏水按 1：20 稀释 ，即 1 份的 20×洗涤缓冲液加 19 份的蒸馏水。

洗板方法
1.手工洗板： 甩尽孔内液体， 每孔加满洗涤液， 静置 1min  后甩尽孔内液体， 在吸水纸上拍干， 如此洗板 5 次。
2.自动洗板机： 每孔注入洗液 350μL， 浸泡 1min， 洗板 5  次。

操作步骤
1.从室温平衡 20min  后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL；
3.样本孔先加待测样本 10μL， 再加样本稀释液 40μL； 空白孔不加。
4.除空白孔外， 标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP） 标记的检测抗体 100μL， 用封板膜封住反应孔 ，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。
5.弃去液体， 吸水纸上拍干， 每孔加满洗涤液， 静置 1min， 甩去 洗涤液， 吸水纸上拍干， 如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物 A 、B  各 50μL，37℃避光孵育 15min。
7.每孔加入终止液 50μL，15min  内， 在 450nm  波长处测定各孔的OD 值。

结果判断
绘制标准曲线： 在 Excel 工作表中， 以标准品浓度作横坐标， 对应 OD 值作纵坐标， 绘制出标准品线性回归曲线， 按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能
1.准确性： 标准品线性回归与预期浓度相关系数 R 值， 大于等于0.9900。
2.灵敏度： 最低检测浓度小于 1.0 pg/mL。
3.特异性： 不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性： 板内 、 板间变异系数均小于 15%。
5.贮藏 ：2-8℃ ,   避光防潮保存。
6.有效期：6 个月

免责声明
1. 试剂盒仅供研究使用， 不得用于临床实验或人体实验， 否则所产生的 一 切后果， 由实验者承担， 本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作， 实验者违反说明书操作， 后果由实验者承担。