氟苯尼考胺快速检测试剂盒使用说明书

【测定原理】
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测牛奶和水产等样本中的氟苯尼考胺，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行，样本中的氟苯尼考胺和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗氟苯尼考胺抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的氟苯尼考胺含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出氟苯尼考胺含量。

【试剂盒技术指标】   
规       格：96孔/盒
灵 敏 度： 0.1ppb
检测时间： 45min
样本检测下限：
组织（鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏）………………0.3 ppb
蜂蜜/蛋类……………………………………0.3 ppb
饲料…………………………………………1.2ppb
血清…………………………………………2ppb
交叉反应率
氟苯尼考胺……………………………………  100%
氟苯尼考胺胺………………………………………15%
氯霉素………………………………………< 0.1%
甲砜霉素……………………………………< 0.1%
回收率
组    织  ………………………………85±10%
血    清  ………………………………80±10%
蜂    蜜  ………………………………80±10%
饲料/蛋类……………………………75±10%

【试剂盒组成】   
1、微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）
1、标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
2、高浓度标准品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb
3、酶标记物     7ml………………… 红色帽
4、抗体工作液  7ml………………… 绿色帽
5、底物A液     7 ml…………………棕色帽
6、底物B液     7 ml …………………黑色帽
7、终止液     　7 ml …………………黄色帽
8、20X浓缩洗涤液40 ml……………白色帽
9、2X浓缩复溶液 50 ml ……………蓝色帽

【所用仪器、试剂】   
具备的仪器：具备的仪器：微孔板酶标仪、氮气吹干装置（样品浓缩仪）、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g ）
微量移液器：单道 20ul～200ul、100ul～1000ul
多道 250 ul
试          剂： 乙酸乙酯、正己烷、去离子水

【实验前溶液配制】
配液1、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释
（1 份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。
配液2、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子
                  水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去
                 离子水），或按 所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】   
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（1）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、猪、牛、羊、兔、鱼、虾等。
（2）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（3）实验之前须检查各种实验器具是否干净，
必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本处理方法
（a）组织（鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏）样本处理方法：
1.     用均质器均质组织样本；
2.     称3±0.05g样本于离心管中，先加入3ml去离子水充分混匀再加入6ml乙酸乙酯，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；
3.     取出2ml上层液体在50-60℃下氮气/空气吹干或旋转蒸发仪蒸干
4.    加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml稀释后的复溶液强烈振荡30s，室温4000r/min以上离心15min。
5.    取50 µl下层相用于分析。
       样本稀释倍数：1倍    
（b）蜂蜜/蛋类
1、取2±0.05 g样本，放入离心管中；
2、加入6ml乙酸乙酯上下振荡5min；
3、室温4000r/min以上离心10min；
4、取3ml上层清澈液到另一离心管中，50-60℃氮气流下干燥
5、用1ml稀释后的复溶液溶解，混合30s；
6、取50 µl用于分析。
样本稀释倍数：1    
（C）饲料
1、取2±0.05 g样本，放入离心管中；
2、加入8ml乙酸乙酯上下振荡5min；
3、室温4000r/min以上离心10min；
4、移取4ml上层清澈液到另一离心管中，50-60℃氮气流下干燥；
5、加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml稀释后的复溶液强烈振荡30s，室温4000r/min以上离心15min。
6、取50 µl取150 µl稀释后的复溶液溶解，混合30s；
7、取50 µl与用于分析。
样本稀释倍数：4
（d）血清样品处理方法（样本稀释倍数: 20 倍）
1、取出50μl血清与950μl已稀释后的复溶液，混30s；
2、取50 μl 用于分析

【酶标免疫分析程序】   
1、从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
4、加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶标记物50µl/孔,然后加入抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。
5、取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6、显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
7、测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】   
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与氟苯尼考胺的含量成负相关。
1、粗略判定：
    用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.510；0.1ppb为1.320；0.3ppb为1.030；0.9ppb为0.660； 2.7ppb为0.389；8.1ppb为0.198。则样本1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb； 样本2的浓度范围是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟苯尼考胺实际浓度。
2、定量判定：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝    B/B0×100%    
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以氟苯尼考胺标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟苯尼考胺实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大
量样品的准确、快速分析。
3、标准准曲线：
4、再现性：
由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出氟苯尼考胺检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应氟苯尼考胺浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】   
7、使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
8、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
9、混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
10、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
11、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
12、不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
13、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
14、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】
原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】
有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。