仅供科研使用，不得用于临床检验。
小鼠双氢睾酮（DHT） ELISA Kit说明书

【产品名称】
通用名称：小鼠双氢睾酮（DHT）定量检测试剂盒（ELISA）
英文名称：Mouse Dihydro testosterone ELISA KIT

【包装规格】
96T/48T
【预期用途】
仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中双氢睾酮（DHT）的浓度。 【检验原理】
本试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗双氢睾酮（DHT）抗体（固 相抗体）的微孔酶标板中，加入小鼠 双氢睾酮（DHT）校准品和待测样本，再加入 HRP 标记 的小鼠 双氢睾酮（DHT）抗原（酶标抗原），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微 孔板固相表面形成固相抗体-酶标抗原的免疫复合物。加底物 A 和 B，底物在 HRP 催化下，产 生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪 450nm 波长上测定吸 光度（OD 值），吸光度（OD 值）与待测样品中小鼠 双氢睾酮（DHT）的浓度负相关。拟合校 准品曲线，可以计算出样本中小鼠 双氢睾酮（DHT）的浓度。

【主要组成成分】 主要成分
组分        数量        主要成分        开封后储存
校准品        0.35ml/管        --        2-8℃14 天
包被微孔板    96T/48T        预包被固相抗体    2-8℃14 天
HRP 标记抗原    10mL        HRP 标记的检测抗原    2-8℃180 天
底物液 A        6mL        0.01%过氧化氢    2-8℃180 天
底物液 B        6mL        0.1%TMB        2-8℃180 天
终止液        6mL        2mol/L 稀硫酸    2-8℃180 天
20×浓缩洗涤液    25mL        0.05%Tween20    2-8℃180 天
说明书        1 份        --        --
自封袋        1 个        --        --
不干胶        2 片        --        --
标准品浓度依次为：40 、20 、10 、5 、2.5 、0 nmol/L

本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材
1、酶标仪
2、精密移液器及一次性吸头
3、蒸馏水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、500ml 量筒
7、无粉一次性乳胶手套

【储存条件及有效期】
1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期 6 个月。
2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回 2-8℃冰箱。
3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和 HRP 标记抗体，有效期为 14 天， 其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。

【适用仪器】
半自动的酶标仪，如 Thermo MK3，或者国产酶标仪。

【样本要求】
样本类型和采集
以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。
1、细胞培养上清：4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm 条件 下离心 20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在 4000rpm 条件下，离心 20 分钟取上 清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
4、组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织 剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按 1: 9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品 对应 9 mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入 蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对
匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液 5000×g 离心 5-10 分钟，取上清检测。

样本保存和稳定性
样本在 2-8℃条件下，可以储存 72h，或者在- 20℃储存 6 个月。样本收集后，不是一次 检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分 解冻。

【检验方法】 试剂准备
1、使用前，所有的组分都要至少复温 30min，确保充分复温到室温。
2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使 结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按 1:20 稀释，即 1 份的浓缩洗涤液，添加 19 份的蒸 馏水。

操作程序
1. 按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
2. 从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。设置标准品孔、空白孔和 样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μL，空白孔不加，样本孔加待测样本 50 μL。
3. 除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原 100 μL。
4. 用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20S，甩去洗涤液，吸水 纸上拍干，如此重复 5 次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡 30s 的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分 拍干反应板。
6. 将底物 A 和 B 按 1:1 体积充分混合，所有孔中加入底物混合液 100 μL。用封板膜盖住反 应板，37℃水浴锅或恒温箱温育 15min。
7. 所有孔加入终止液 50 μL，在 450 波长的酶标仪上读取各孔吸光度（OD 值）。

 

【实验结果计算】
检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD 值）作为横坐标，利用计算 机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品的浓度值。
如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

【检验方法的局限性】
1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、使用试剂盒配套的样品稀释液。
5、如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。
6、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

【产品性能指标】
1. 外观和物理检查:试剂盒应组分齐全，内外包装均应完整，标签清晰，液体试剂无渗漏。 各组分装量不少于表 1 中要求。
2. 线性: 用四参数 Logistic 曲线拟合（4-pl），在 2.5 nmol/L – 40 nmol/L 范围内，剂量- 反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于 0.9900。
3. 精密度
3.1 分析内精密度:试剂盒质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于 15.0%。
3.2 批间精密度:在三个不同批次产品之间，质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于 15.0%
4. 最低检出限:最低检测浓度小于 0.1 nmol/L。
5. 质控品测定值: 每次检测结果均应在允许范围内。

【注意事项】
生物安全
1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废 弃物都应按照传染物进行处置。
2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300 防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟 雾与皮肤接触。
3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成 后彻底洗手。

技术提示
1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样， 避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为 黄色。
6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行 温育操作。

废物处理
所有使用或未使用的试剂，所有污染性的一次性材料，应当遵循传染性或潜在传染性产品 的处理程序，每个实验室都有责任根据其实验的类型和危险性级别，进行废物和污物的处理， 同时要严格依照有关规定对待所有的废物和污物。