细胞 AMPK 激酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
细胞 AMPK 激酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到 AMPK 磷酸化后，进而由丙酮酸 激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生 ADP 过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NADH）的氧化反应， 即采用比色法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中AMPK 活性的 权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取 液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中AMPK 激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。 产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景
5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine      protein kinase）家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物，由3个亚体， α 、 β 、 γ构 成：其中γ亚体有4个胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）结构域，又称为巴特曼（Bateman）结 构域，以探测AMP和ATP的比例； α亚体含有催化结构域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD  复合  物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式，包括α 1 、 α2 、 β 1 、 β2 、 γ 1、 γ2  和 γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定：促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄糖吸收 和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高度表达。其磷酸化目标序列为 XXXXXXXXXXXX。 基于底物XXXXXXXXXXXX，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽， 进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还 原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌  呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析5’AMP活化  蛋白激酶的活性。其反应方式为：

产品内容    
清理液（Reagent A）        毫升
裂解液（Reagent B）        毫升
缓冲液（Reagent C）        毫升
酶促液（Reagent D）    微升
反应液（Reagent E）        微升
底物液（Reagent F）        微升
阴性液（Reagent G）    微升
产品说明书        1 份

保存方式    
保存清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保 证 6 月

用户自备
1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器 细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
比色皿或酶标板：用于比色分析操作的容器 分光光度仪或酶标仪：用于样品比色分析

实验步骤
一、 待测样品准备
1． 准备好 25cm2 细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 106 细胞）
2． 小心加入 3 毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5． 加入 3 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入 500 微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的 1.5 毫升离心管
11．强力涡旋震荡 15 秒
12．置于冰槽里孵育30 分钟
13．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM ，例如 eppendorf 5415）
14．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管
15．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备
1 ． 准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里
2 ． 设定好分光光度仪（温度为 30℃)：波长为 340nm ，间隔 5 分钟，读数 7 次（共 30 分钟），并置零

三、 背景对照测定
1． 移取 65 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入 10 微升酶促液（Reagent D）
3． 加入 5 微升阴性液（Reagent G）
4． 放进 30℃培养箱里静置 2 分钟
5． （选择步骤）放进分光光度仪，置零
6． （选择步骤）取出比色皿
7． 加入 10 微升反应液（Reagent E）
8． 加入 10 微升底物液（Reagent F）
9． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
10．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟

四、 样品测定
1． 移取 65 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入 10 微升酶促液（Reagent D）
3． 加入 5 微升待测样品（注意：50 微克组织蛋白；样品须溶解）
4． 放进 30℃培养箱里静置 2 分钟
5． （选择步骤）放进分光光度仪，置零
6． （选择步骤）取出比色皿
7． 加入 10 微升反应液（Reagent E）
8． 加入 10 微升底物液（Reagent F）
9． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
10．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟

五、 计算样品活性

六、酶标板测定
1 ． 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2 ． 分别移取 65 微升缓冲液（Reagent C）到 96 孔板中
3 ． 分别加入 10 微升酶促液（Reagent D）
4 ． 分别加入 5 微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50 微克组织蛋白）到相应孔中（注意：样品须清 澈）
5 ． 轻轻摇动 96 孔酶标板
6 ． 在 30℃温度下孵育 2 分钟
7 ． 分别加入 10 微升反应液（Reagent E）
8 ． 分别加入 10 微升底物液（Reagent F）
9 ． 轻轻摇动酶标板
10 ．即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和30 分钟读数
11．活性计算：

注意事项
1 ． 本产品为 20 次操作，包括背景操作
2 ． 操作时，须戴手套
3 ． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4 ． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5 ． 样品须澄清，至关重要
6 ． 加入底物液（Reagent F）后 3 秒内即刻比色测定
7 ． 测定值由高到低变化；测定可持续 30 分钟
8 ． 比色测定后，比色皿须清洗彻底
9 ． 样本测定 0 分钟读数高于 30 分钟读数表明具有酶活性
10 ．建议待测样本蛋 白浓度为 50 微克/5 微升（本 公 司提供  Bradford 蛋 白质浓度定量试剂盒-G&VS30030. 1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12 ．可以使用AMPK 抑制剂（DORSOMORPHIN）作为抑制剂对照或阴性对照
13 ．5’AMP 活化蛋白激酶活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
14 ．本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准
1 ． 本产品经鉴定性能稳定
2 ． 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后， 应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证 说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告） 与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作 所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
编号        名称                    规格
G&VS50140. 1.3    细胞 AMPK 激酶活性比色法定量检测试剂盒        20 次
G&VS50140. 1.3A    清理液（Reagent A）                500 毫升
G&VS50140. 1.3B    裂解液（Reagent B）                100 毫升
G&VS50140. 1.3C    缓冲液（Reagent C）                50 毫升
G&VS50140. 1.3D    酶促液（Reagent D）            5 毫升
G&VS50140. 1.3E    反应液（Reagent E）                5 毫升
G&VS50140. 1.3F    底物液（Reagent F）                5 毫升
G&VS50140. 1.3G    阴性液（Reagent G）            5 毫升

产品编号        名称                    规格
G&VS50054.1    细胞 Akt1/PKBα激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50054.2    组织 Akt1/PKBα激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50054.3    细胞 Akt2/PKBβ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50054.4    组织 Akt2/PKBβ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50054.5    细胞 Akt3/PKBγ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50054.6    组织 Akt3/PKBγ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50056.1    细胞 ERK1/2 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50056.2    组织 ERK1/2 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50057.1    细胞 P38α激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50057.2    组织 P38α激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50058.1    细胞 PI3K 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50058.2    组织 PI3K 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50059.1    细胞 PKA 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50059.2    组织 PKA 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50060.1    细胞 Src 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50060.2    组织 Src 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50126.1    细胞 PKC 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50126.2    组织 PKC 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50140.1    细胞 AMPK 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50140.2    组织 AMPK 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50159.1    细胞 ERK1 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50159.2    组织 ERK1 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50159.3    细胞 ERK2 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50159.4    组织 ERK2 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50161.1    细胞 GSK3α激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50161.2    组织 GSK3α激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50161.3    细胞 GSK3β激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50161.4    组织 GSK3β激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50171.1    细胞 P38β2 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50171.2    组织 P38β2 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.1    细胞 PKCα激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.2    组织 PKCα激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.3    细胞PKCβ1 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.4    组织PKCβ1 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.5    细胞 PKCβ2 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.6    组织 PKCβ2 激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.7    细胞 PKCγ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.8    组织 PKCγ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.9    细胞 PKCδ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.10    组织 PKCδ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178. 11    细胞 PKC ε激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178. 12    组织 PKC ε激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.13    细胞 PKCζ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178. 14    组织 PKCζ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.15    细胞 PKCη激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.16    组织 PKCη激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.17    细胞 PKC θ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.18    组织 PKC θ激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.19    细胞 PKC ι激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50178.20    组织 PKC ι激酶活性比色法定量检测试剂盒    20 次