细胞黑色素含量比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
细胞黑色素含量比色法定量检测试剂是一种旨在通过碱性水解后释放出可溶性黑色素分子，直接由分光光度仪比色分析，定量检测细胞样品黑色素含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种细胞（动物、人体等）裂解悬液的黑色素含量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测准确。

技术背景
黑色素（melanin）是一种酪氨酸衍生物复合物，广泛存在于原核生物、动物和植物中。作为一组棕黑色的沉积色素，黑色素不含铁但含硫，不溶于水和有机溶剂，能在强碱中长时间后被溶解，被强氧化剂脱色。黑色素分成两种：优黑素（eumelanin）和褐黑素（pheomelanin）。前者为棕黑色二羟基吲哚（dihydroxyindole）、二羟吲哚羧酸（dihydroxyindole carboxylic acid）及其还原产物的多聚体；后者为棕红色的苯并噻嗪类（benzothiazine）分子。黑色素与蛋白质结合，形成复合物，通常存在于皮肤、眼睛和大脑黑质（substantia nigra）中。黑色素细胞（melanocytes）产生黑色素，存储在细胞浆的黑色素颗粒中。通过多巴氧化酶（DOPA Oxidase）的作用，使黑色素转化成黑色的多巴黑色素（dopa melanin）。黑色素的显著增加，与黑色素瘤（melanoma1）有关。基于含有黑色素的样品在碱性水解后释放出可溶性黑色素分子，直接通过分光光度仪（360nm波长）检测，产生吸光峰值的变化，来测定黑色素的总含量。

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
裂解液（Reagent B）        毫升
处理液（Reagent C）        毫升
溶解液（Reagent D）    毫升
缓冲液（Reagent E）        毫升
标准液（Reagent F）        毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存标准液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，溶解液（Reagent D）、缓冲液（Reagent E）和标准液（Reagent F）具有腐蚀性，严格注意操作安全；有效保证6月

用户自备
1.5毫升离心管：用于标准液配制和样品制备的容器
恒温培养箱或恒温水槽：用于反应孵育
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
微型台式离心机：用于样品操作
比色皿：用于比色分析的容器
分光光度仪：用于比色分析

实验步骤
一、样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管——作为蛋白定量检测之用
15．移取10微升上清液进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
16．加入xx微升处理液（Reagent C）到细胞沉淀颗粒管（注意：无需混匀）
17．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
18．小心抽去上清液
19．加入xx微升溶解液（Reagent D），混匀
20．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
 
二、标准样品配制
1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2．分别加入xx微升缓冲液（Reagent E）到1至5号管
3．移取xx微升标准液（Reagent F）到1号管，混匀
4．小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent F）到2号管，混匀
5．小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent F）到3号管，混匀
6．小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent F）到4号管，混匀
7．将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

管号    缓冲液（Reagent E）        标准液（Reagent F）        测定体系标准黑色素含量
1    xx微升            xx微升            xx微克
2    xx微升            xx微升1号管        xx微克
3    xx微升            xx微升2号管        xx微克
4    xx微升            xx微升3号管        xx微克
5    xx微升            0            0

三、标准曲线测定
1．加入xx微升缓冲液（Reagent E）到新的比色皿
2．加入xx微升上述配制的标准液（Reagent F），混匀
3．放进60℃恒温水槽孵育30分钟，避免光照
4．即刻放进分光光度仪检测（波长360nm）：获得吸光读数
5．重复实验步骤1至4四次
6．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准黑色素含量（微克）

四、样品测定
1．加入xx微升缓冲液（Reagent E）到新的比色皿
2．加入500微升上述制备的样品，混匀
3．放进60℃恒温水槽孵育30分钟，避免光照
4．即刻放进分光光度仪检测（波长360nm）：获得样品吸光读数
5．根据标准曲线获得样品对应黑色素含量

五、含量计算

注意事项
1．本产品为25次操作，包括标准样品
2．操作时，须戴手套
3．系统操作时，标准样品测定只需1次
4．溶解液（Reagent D）、缓冲液（Reagent E）和标准液（Reagent F）具有腐蚀性，严格注意操作安全
5．孵育时，避免光照
6．通常黑色素含量表述为：微克/毫克蛋白；微克/毫升；微克/细胞总量
7．本公司提供系列黑色素检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                规格    
G&VS50365.1    细胞黑色素含量比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50365.1A    清理液（Reagent A）            毫升
G&VS50365.1B     裂解液（Reagent B）            毫升
G&VS50365.1C     处理液（Reagent C）            毫升
G&VS50365.1D    溶解液（Reagent D）        毫升
G&VS50365.1E     缓冲液（Reagent E）            毫升
G&VS50365.1F     标准液（Reagent F）            毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                规格
G&VS50365.1    细胞黑色素含量比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50365.2    组织黑色素含量比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50365.3    真菌/酵母黑色素含量比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50365.4    植物黑色素含量比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS80023.1    石蜡切片黑色素（MELANIN）染色试剂盒    50次
G&VS80023.2    冰冻切片黑色素（MELANIN）染色试剂盒    50次
G&VS80023.3    细胞黑色素（MELANIN）染色试剂盒    50次
G&VS80024.1    石蜡切片黑色素去色试剂盒        50次
G&VS80024.2    冰冻切片黑色素去色试剂盒        50次