细胞长链酮脂酰辅酶A硫解酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
细胞长链酮脂酰辅酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用酮脂酰辅酶A作为底物，在镁离子和辅酶A的激活下，底物解离后峰值的降低，即采用比色法来测定组织裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体、植物、昆虫等）长链酮脂酰辅酶A硫解酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β-氧化及最后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2和H2O，并释放能量等四个阶段。硫解酶（Thiolase）存在于真核和原核生物的细胞里，分成两种类型：一种为酮脂酰辅酶A硫解酶（3-ketoacyl-CoA thiolase；EC: 2.3.1.16），另一种为乙酰乙酰辅酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase；EC: 2.3.1.9）。酮脂酰辅酶A硫解酶又称为硫解酶I（thiolase I），以各种链长脂肪酸为底物，催化脂肪酸β-氧化的最终反应，释放乙酰辅酶A，同时产生短缺2个碳基的脂酰辅酶A。在真核生物中，酮脂酰辅酶A硫解酶又分为线粒体型和过氧化酶体型。长链酮脂酰辅酶A（例如酮十六脂酰辅酶A；3-ketohexadecanoyl-CoA）在长链硫解酶I的催化下，发生镁-烯醇化物（Mg-enolate）的裂解，致长链酮脂酰辅酶A底物的减少，在分光光度仪（303nm）下，吸光值降低，来定量分析长链酮脂酰辅酶A硫解酶的活性。长链酮脂酰辅酶A硫解酶反应系统为：

产品内容
清理液（Reagent A）     毫升
裂解液（Reagent B）     毫升
缓冲液（Reagent C）     毫升
反应液（Reagent D）     毫升
底物液（Reagent E）        毫升
阴性液（Reagent F）        毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤
一、样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长303nm，间隔30秒，读数5次（共3分钟），并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化
3．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent D）
3．加入xx微升底物液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在25℃温度下孵育3分钟
6．加入xx微升阴性液（Reagent F）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－3分钟读数）

四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent D）
3．加入xx微升底物液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在25℃温度下孵育3分钟
6．加入50微升待测样品（10微克蛋白总量）（注意：样品须清澈）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－3分钟读数）

五、计算样品活性
 
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3．分别加入xx微升反应液（Reagent D）
4．分别加入xx微升底物液（Reagent E）
5．轻轻摇动96孔板
6．在25℃温度下孵育3分钟
7．分别加入xx微升阴性液（Reagent F）或待测样品（10微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
8．轻轻摇动96孔板
9．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和3分钟读数
10．活性计算：

注意事项
1．本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．建议使用比色皿测定
5．样品须澄清，至关重要
6．加样后3秒内比色测定
7．测定值由高到低变化；测定可持续5分钟
8．比色测定后，比色皿须清洗彻底
9．样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为10微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．长链酮脂酰辅酶A硫解酶单位活性定义为：在25℃，pH 8.0条件下，每分钟内能够硫解1微摩尔酮脂酰辅酶A所需的酶量作为一个活性单位
13．本公司提供系列脂肪酸β氧化检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组份订购信息
编号            名称                    规格        
G&VS50122.1.3    细胞长链酮脂酰辅酶A硫解酶活性比色法定量检测试剂盒        20次        
G&VS50122.1.3A    清理液（Reagent A）                    毫升
G&VS50122.1.3B     裂解液（Reagent B）                    毫升
G&VS50122.1.3C    缓冲液（Reagent C）                    毫升
G&VS50122.1.3D     反应液（Reagent D）                毫升
G&VS50122.1.3E     底物液（Reagent E）                    毫升
G&VS50122.2F     阴性液（Reagent F）                    毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                                规格
G&VS50122.1.1    细胞短链酮脂酰辅酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50122.1.2    细胞中链酮脂酰辅酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50122.1.3    细胞长链酮脂酰辅酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50122.2.1    组织短链酮脂酰辅酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50122.2.2    组织中链酮脂酰辅酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50122.2.3    组织长链酮脂酰辅酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量检测试剂盒    20次