细胞长链脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）活性比色法定量检测试剂盒

主要用途
细胞长链脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过长链脂酰辅酶A氧化酶和过氧化物酶耦联反应系统，测定样品中的长链脂酰辅酶A氧化后产物，转化为有色醌亚胺，即采用比色法来测定细胞裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体等）长链脂酰辅酶A氧化酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体和过氧化物体发生的脂肪酸代谢通路。其中过氧化物体β氧化主要降解各种不同的脂肪酸及其衍生物，例如二十碳脂肪酸（eicosanoid） ：前列腺素（prostaglandins）、白细胞三烯（leukotrienes）和凝血恶烷(thromboxanes)；二羧基脂肪酸（dicarboxylic fatty acids）、超长链脂肪酸、降植烷酸（pristanic acid）、胆汁酸中间产物（bile acid intermediates）：二和三羟基前列腺烷酸（di- and trihydroxycoprostanoic acids）以及外源性化合物（xenobiotics）等。脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase；ACO；EC1.3.3.6），又称为酯酰辅酶A氧气-2-氧化还原酶（acyl-CoA:oxygen 2-oxidoreductase）是过氧化物体脂肪酸代谢进入β-氧化后的第一步限速催化反应的关键酶，主要作用于8至18碳的脂肪酸辅酶A衍生物，分成二至三种底物特异性的种类：小于6个碳（C6）的短链（主要是植物），介于6至12个碳（C6－C12）的中链，和大于12个碳（C12）的长链脂酰辅酶A氧化酶，共同参与脂肪酸代谢、多聚不饱和脂肪酸生物合成和PPAR信号通路等。脂酰辅酶A氧化酶是同源二聚体的黄素类蛋白（flavoprotein），催化脂酰辅酶A为反式烯脂酰辅酶A（trans-2-enoyl CoA）。人体以长链脂酰辅酶A氧化酶为主，如果缺陷，则导致罕见的遗传性神经退行性疾病假新生儿肾上腺白质退化症（pseudoneonatal adrenoleukodystrophy），出现精神发育迟缓（mental retardation）、白质退化、抽搐、轻度肝肿大以及听力缺失等。基于长链脂酰辅酶A棕榈酰辅酶A（palmitoyl-CoA）作为底物，在长链脂酰辅酶A氧化酶的氧化作用下，提供电子给分子氧，从而产生反式2,3脱氢脂酰辅酶A（trans-2,3-dehydroacyl CoA）和过氧化氢，继而与4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine； 4-AA）反应，过氧化物酶（peroxidase）帮助生成红色的有色醌亚胺（quinoneimine dye），在分光光度仪（510nm 波长）下，来定量分析长链脂酰辅酶A氧化酶的活性。长链脂酰辅酶A氧化酶反应系统为：

                              
产品内容
清理液（Reagent A）      毫升
裂解液（Reagent B）      毫升
缓冲液（Reagent C）      毫升
反应液（Reagent D）      毫升
底物液（Reagent E）     毫升
阴性液（Reagent F）         毫升
产品说明书        1份

保存方式
保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤
一、样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长500nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照
3．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent D）
3．加入xx微升底物液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在30℃温度下孵育3分钟
6．加入xx微升阴性液（Reagent F）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（5分钟读数－0分钟读数）

四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（Reagent D）
3．加入xx微升底物液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在30℃温度下孵育3分钟
6．加入50微升待测样品（100微克总蛋白）（注意：样品须清澈）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数）

五、计算样品活性
 
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3．分别加入xx微升反应液（Reagent D）
4．分别加入xx微升底物液（Reagent E）
5．轻轻摇动96孔板
6．在30℃温度下孵育3分钟
7．分别加入xx微升阴性液（Reagent E）或待测样品（50微克总蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
8．轻轻摇动96孔板
9．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
10．活性计算：

注意事项
1．本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．建议使用过氧化物体裂解蛋白作为待测样品为佳
5．建议使用比色皿测定
6．样品须澄清，至关重要
7．加样后3秒内比色测定
8．测定值由低到高变化；测定可持续5分钟
9．比色测定后，比色皿须清洗彻底
10．样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
11．建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
12．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
13．长链脂酰辅酶A氧化酶单位活性定义为：在30℃，pH 8.0条件下，每分钟内产生1微摩尔过氧化氢所需的酶量作为一个活性单位
14．本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组份订购信息
编号        名称                    规格        
G&VS50123.1.3    细胞长链脂酰辅酶A氧化酶活性比色法定量检测试剂盒    20次        
G&VS50123.1.3A    清理液（Reagent A）                毫升
G&VS50123.1.3B     裂解液（Reagent B）                毫升
G&VS50123.1.3C    缓冲液（Reagent C）                毫升
G&VS50123.1.3D     反应液（Reagent D）            毫升
G&VS50123.1.3E     底物液（Reagent E）                毫升
G&VS50123.1.3F     阴性液（Reagent F）                毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                            规格
G&VS50123.1.1    细胞短链脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50123.1.2    细胞中链脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50123.1.3    细胞长链脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50123.2.1    组织短链脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50123.2.2    组织中链脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）活性比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS50123.2.3    组织长链脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）活性比色法定量检测试剂盒    20次