乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）活性检测试剂盒说明书微量法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格:100T/48S

产品简介：
乙酰辅酶 A 羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase ，ACC）在生物体内催化乙酰辅酶 A 羧化生成丙二酰 辅酶 A ，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC 的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合 成速度和含油量的高低。
ACC 能够催化乙酰辅酶 A 、NaHCO3 和 ATP 生成丙二酰辅酶 A 、ADP 和无机磷，钼蓝与磷酸根生 成 660nm有特征吸收峰的物质，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 活性。

试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵 /匀浆器、漩涡震荡仪、水浴锅、蒸馏水、冰盒、EP 管。

产品内容：
提取液一：液体 110mL×1 瓶，4℃保存；
提取液二：液体 1mL×1 支，-20℃避光保存； 试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 2.5mL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保 存，避免反复冻融；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 2mL 双蒸水，充分溶解待用；可分装后-20℃保存， 避免反复冻融；
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 双蒸水，溶解后 4℃保存一周； 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 双蒸水，溶解后 4℃保存一周； 试剂六：液体 5mL×1 瓶，室温保存；
标准品：10μmol/mL 标准磷贮备液 1mL×1 支，4℃保存；
提取液的配制：按提取液一：提取液二=990：10（V：V）的比例配制，根据样本量现配现用， 禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。
工作液（定磷剂）的配制：按 H2O ：试剂四：试剂五：试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的工作 液应为浅黄色。若变色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，工作液应现配现用。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 操作步骤：

一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g ，4℃ , 离心 10min ，取上清置于冰上待测。
细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104  个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）； 然后 8000g ，4℃, 离心 10min ，取上清置于冰上待测。
血清（浆）：直接测定。

二、测定步骤：
1 、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm ，蒸馏水调零。
2 、 临用前将试剂一、试剂二、试剂三在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 10min。
3 、 将 10μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 1.25 、0.625 、0.3125 、0.15625 、0.078μmol/mL 的标准溶 液备用。
4 、 操作表：
酶促反应：(在 1.5ml 离心管中依次加入下列试剂)
试剂名称        对照管    测定管
试剂一 (µL）    90    
试剂二 (µL）    -    50
试剂三 (µL）    -    40
样本 (µL）    10    10
37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 30min 后，沸水浴 5min（盖紧， 以防止水分散失），冷却后，10000g  ，25℃离心 5min ，取上清。
定磷反应：
试剂名称    标准管    空白管    对照管    测定管
标准溶液 (μL）    20    -    -    -
H2O  (µL）    -    20    -    -
上清液 (µL）    -        20    20
工作液 (µL）    180    180    180    180
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）反应 30min ，冷却至室温，在 660nm 处，蒸馏水调零，记录各管吸光值 A ，分别记为 A 标准管、A 空白管、A 对照管和 A 测  定管。ΔA=A 测定管-A 对照管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。标准管、空白管只要做一次 即可，每个测定管需要设一个对照管。

三、ACC 活性计算
1 、 标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b ，将 ΔA 带入方程得到 x  (μmol/mL）
2 、 ACC 活性的计算：
（1） 按蛋白浓度计算
酶活定义：每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位 ACC 酶活（U /mg prot）=x×V 总÷（V 样×Cpr）÷T=20x÷Cpr。
（2） 按样本质量计算
酶活定义：每小时每 g 组织产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC 酶活（U/g 鲜重）=x×V 总÷（V 样×W÷V 样总）÷T=20x÷W。
（3） 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义：每小时每 104  个细菌或细胞产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC 酶活（U /104  cell）=x×V 总÷（V 样×细胞数量（万个）÷V 样总）÷T =20x÷细胞数量（万个）。
（4） 按液体体积计算
酶活定义：每小时每 mL 液体产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。 ACC 酶活（U /mL）=x×V 总÷V 样÷T=20x。
V 总：酶促反应总体积，0.1mL；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL； T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL ，蛋白浓度自行测定；W ：样本鲜重，g。
注意事项
1 、 工作液（定磷剂）应现配现用，正常颜色为浅黄色，如有变色或变蓝则均为失效。
2 、 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管或 EP 管等试验器材均要求严格无磷。
3 、 显色结束后应立即检测。
4 、 当ΔA 大于 1.5 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。