亚硝酸还原酶（NiR）活性检测试剂盒说明书

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
规格：100T/48S

产品内容：
试剂一：液体112mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体1.5mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体1mL×1支，4℃保存。
试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加0.6mL蒸馏水溶解。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加3.2mL蒸馏水溶解。
显色剂A：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。
显色剂B：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。
临用前根据用量将显色剂A和显色剂B以1:1的比例混合。

产品说明：
硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然 界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3 ，从而减少环境中的亚硝态氮的积累， 降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO ，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2—减少， 即540nm处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。

自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量比色皿/96孔板、水浴锅。

操作步骤:
一、酶液提取
1.  组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~ 10的比例（建议称取约0. 1g组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，然后10000g ，4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
2 、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~ 1000：1的比例（建议500万细 胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w ，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后 10000g ，4℃ , 离心10min ，取上清置于冰上待测。
二、测定操作表
    空白管    对照管    测定管
试剂一 (μL）    140    120    110
试剂二 (μL）    12    12    12
试剂三 (μL）    10        10
试剂四 (μL）    6    6    6
试剂五 (μL）    32    32    32
样品 (μL）        30    30
混匀后，37℃反应1h
显色剂 (μL）    40    40    40
充分混匀，25℃静置显色10min ，蒸馏水调零，于微量比色皿/96孔板中测定540nm  处各管 吸光值，记为A空白管、A  对照管和A  测定管。
注意：空白管只要做一管

三、计算公式:
1. 使用微量比色皿测定的计算公式如下： 标准曲线：y=0.0136x-0.005 ，R2=0.9981；
1 、按照蛋白含量计算
酶活性定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO2— 的量为一个酶活力单位。
NiR  (μmol/h /mg prot）=[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷0.0136×V反总÷（V样×Cpr）÷T = 490.2×[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷Cpr
2 、按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每小时还原1μmol NO2— 的量为一个酶活力单位。
NiR  (μmol/h /g鲜重）=[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷0.0136×V反总÷（W×V样÷V样总） ÷T= 490.2×[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷W
3 、按照细胞数量计算
酶活性定义：每104细胞每小时还原1μmol NO2— 的量为一个酶活力单位。
NiR  (μmol/h /104 cell）=[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷0.0136×V反总÷（细胞数量×V样 ÷V样总）÷T= 490.2×[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷细胞数量
V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：体系中加入样本体积，0.03mL； V  样总：加入提取
液体积，1mL；W：样本质量，g；T ：反应时间，1h；Cpr：样本蛋白含量。
2.   用96  孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.0068x-0.005 ，R2=0.9981；
1 、按照蛋白含量计算
酶活性定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO2— 的量为一个酶活力单位。
NiR  (μmol/h /mg prot）=[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷0.0068×V反总÷（V样×Cpr）÷T = 980.4×[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷Cpr
2 、按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每小时还原1μmol NO2— 的量为一个酶活力单位。
NiR  (μmol/h /g 鲜重）=[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷0.0068×V反总÷（W×V样÷V样总） ÷T= 980.4×[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷W
3 、按照细胞数量计算
酶活性定义：每104细胞每小时还原1μmol NO2— 的量为一个酶活力单位。
NiR  (μmol/h /104 cell）=[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷0.0068×V反总÷（细胞数量×V样
÷V样总）÷T= 980.4×[ A空白管-（A测定管-A对照管）+0.005] ÷细胞数量
V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：体系中加入样本体积，0.03mL； V  样总：加入提取
液体积，1mL；W：样本质量，g；T ：反应时间，1h；Cpr：样本蛋白含量。
注意事项：
1 、配置好的试剂三、试剂四3天内使用完