通用型（大鼠）线粒体DNA损伤（8-hydroxydeoxyguanosine）比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
通用型（大鼠）线粒体DNA损伤（8-hydroxydeoxyguanosine）比色法定量检测试剂是一种旨在使用单克隆抗8-羟基脱氧鸟苷抗体竞争性结合样品中的8-羟基脱氧鸟苷，进而使用辣根过氧化酶缀合二抗，由生色染料四甲基联苯胺参与反应，呈现黄色产物，即通过比色法定量评价（大鼠）线粒体样品DNA损伤水平的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种大鼠细胞或组织线粒体裂解样品8-羟基脱氧鸟苷的定量分析。广泛用于细胞衰老、细胞凋亡、肿瘤等的研究。产品即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景
核酸氧化损伤（nucleotide oxidative damage），包括DNA和RNA损伤，是由于环境因子或细胞代谢影响，在逃避细胞防御机制的前提下，所产生的四种损伤之一：氧化、烷化（alkylation）、水解和碱基错配损伤等。而氧化损伤主要通过活性氧族（reactive oxygen species；ROS），包括超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）等的作用，使碱基羟基化和嘌呤环裂开，诱导鸟嘌呤（guanine；G）向胸腺嘧啶（thymine；T）的颠换（transversion），造成体细胞基因突变，影响细胞周期、基因转录、细胞凋亡等，最终导致各种疾病的发生，例如糖尿病、高血压、中风、癌症、衰老等。其中核酸损伤产物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine；8-OHdG）作为DNA损伤的分子标志；8-羟基鸟苷（8-hydroxyguanosine）作为RNA损伤的分子标志。8-羟基脱氧鸟苷是最常见的DNA损伤产物，也是氧化应急的生物标志。基于单克隆抗8-羟基脱氧鸟苷抗体竞争性结合样品中的8-羟基脱氧鸟苷，进而使用辣根过氧化酶缀合二抗，由生色染料四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine；TMB）参与反应，呈现黄色产物，在分光光度仪下（450nm波长），定量检测8-羟基脱氧鸟苷的含量。

产品内容
标准液（Reagent A）         微升
酶促液（Reagent B）         毫升
清理液（Reagent C）        毫升
底物液A（Reagent D）    毫升
底物液B（Reagent E）    毫升    
终止液（Reagent F）        毫升
抗体酶标板         列
产品说明书        1份

保存方式
保存在4℃冰箱里；暂时不用，保存在－20℃冰箱里；底物液B（Reagent E）易挥发，密闭瓶盖，避免光照；抗体酶标板，密封干燥保存；有效保证3月

用户自备
1.5毫升离心管：用于工作液配制
培养箱：用于反应孵育
酶标仪：用于比色分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃或4℃冰箱里试剂盒中的试剂置于室温下30分钟均衡温度。然后进行下列操作：
一、标准样品管浓度表：
标准液（Reagent A）         标准8-羟基鸟苷浓度
A1            100纳克/毫升
A2            50纳克/毫升
A3            25纳克/毫升
A4            10纳克/毫升
A5            5纳克/毫升
A6            0

二、标准样品和待测样品测定
1．准备xx列抗体酶标板：标记好标准样品、待测线粒体样品
2．分别加入xx微升标准液A1至A6到对应的标准样品孔里
3．加入100微升待测样品到待测样品孔里
4．分别加入xx微升酶促液（Reagent B）到所有孔里
5．摇动酶标板，充分混匀
6．密封酶标板
7．放进37℃培养箱里孵育60分钟（注意：培养箱保持湿润，避免干化）
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升清理液（Reagent C）
10．室温下孵育10秒
11．小心抽去清理液（注意：确保没有液体残留）
12．重复实验步骤9至11四次
13．准备1个1.5毫升离心管
14．分别加入等量的底物液A（Reagent D）和底物液B（Reagent E），混匀
15．加入xx微升上述配制的底物工作液到标准样品和待测样品孔里
16．室温下孵育15分钟，避免光照（注意：可见蓝色沉淀）
17．加入xx微升终止液（Reagent F），混匀（注意：可见蓝色变成黄色）
18．即刻放进酶标仪测读：450nm波长（注意：不宜超过15分钟）
19．构建8羟基脱氧鸟苷标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光值（OD）；横坐标（X轴）为8-羟基脱氧鸟苷浓度（纳克/毫升）
20．根据标准曲线获得线粒体样品对应8-羟基脱氧鸟苷浓度（纳克/毫升）
 
注意事项
1．本产品为20次操作量
2．本产品检测敏感度达0.1纳克/毫升
3．操作时，须戴手套
4．系统操作时，标准样品测定只需一次
5．孵育时，须避免光照
6．加样时确保加入孔底，避免溅出和气泡
7．注意加样时，避免交叉污染，避免污染母液
8．建议使用湿度充分的培养箱
9．用户根据实际用量，配制底物工作液；须新鲜配制，即刻使用
10．建议染色完成后，即刻进行比色分析
11．本公司提供系列线粒体DNA损伤检测试剂产品
 
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号                名称                    规格        
G&VS10331        通用型（大鼠）线粒体DNA损伤比色法定量检测试剂盒        20次
G&VS10331A         标准液（Reagent A）                    毫升
G&VS10331B         酶促液（Reagent B）                    毫升
G&VS10331C         清理液（Reagent C）                    毫升
G&VS10331D         底物液A（Reagent D）                毫升
G&VS10331E         底物液B（Reagent E）                毫升
G&VS10331F         终止液（Reagent F）                    毫升
G&VS10331G        抗体酶标板                    列

试剂盒订购信息
产品编号                    名称                    规格
G&VS20128.1    通用型线粒体DNA片段常见缺失（CD4977）定性分析试剂盒            20次
G&VS20128.2    通用型线粒体DNA片段常见缺失（CD4977）定量扩增分析试剂盒            20次
G&VS20131    通用型线粒体DNA损伤超长延展定量PCR扩增分析试剂盒            20次
G&VS10329    通用型线粒体DNA损伤AP位点比色法定量分析试剂盒                20次
G&VS10330    通用型线粒体双链DNA断裂（DSB）免疫荧光分析试剂盒            10次
G&VS10331    通用型线粒体DNA损伤（8-hydroxydeoxyguanosine）比色法定量检测试剂盒        20次