土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）

1.  分析意义
土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在 pH4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明， 磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及 pH 也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷 素生物转化方向与强度的指标。

2.  试验原理
Kroll 等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质， 以酚的释放量表示磷酸酶活性。测定 磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通称为有机 基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适 pH：4-5 ，6-7 和 8-10 。所以，测定酸性、中性和碱性反 应土壤的磷酸酶，要提供相应的 pH 缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶 常采用的 pH 缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基 氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘 油磷酸钠、 α或β萘酚磷酸钠、 ρ-硝基苯磷酸钠等。

3. 试剂配制
a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；
b. pH5 醋酸盐缓冲液、pH7 柠檬酸盐缓冲液、pH9.4 硼酸盐缓冲液；
c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取 0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用 10mL 96％乙醇 溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；
d. 酚的标准溶液：
酚原液－取 1g 重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至 1L，贮于棕色瓶中；
酚工作液－取 10mL 酚原液稀释至 1L（每毫升含 0.01 毫克酚）；
e. 甲苯；
f. 0.3％硫酸铝溶液。

4. 标准曲线绘制：
取 1、3、5、7、9、11 和 13mL 酚工作液，置于 50mL 容量瓶中，每瓶加入 5mL 缓冲液和 4 滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得 0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、
0.0018、0.0022 和 0.0026mg ·g-1 浓度的酚标准溶液梯度。30min 后比色测定。绘制标准曲
线。

5. 试验步骤
5g 风干土置于 200mL 三角瓶中，加 2.5mL 甲苯，轻摇 15min 后，加入 20mL 0.5％磷酸 苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐 缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在 37℃下培养 24h。后于培养液中加 100mL 0.3％硫酸 铝溶液并过滤。
吸取 3mL 滤液于 50mL 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时， 呈现蓝色，在风光光度计上于660nm 处比色。

6. 结果计算
磷酸酶活性， 以 24h 后 1g 土壤中释放处的酚的毫克数表示。 酚（mg . g—1）=
c－标准曲线上查得的酚浓度,mg ·mL-1；
50－显色液体积，mL；
ts－分取倍数（这里是 40＝（20+100）/3）
m－土壤质量，g。

方法来源：关松荫.  土壤酶及其研究法.  北京:  农业出版社, 1986.