体液甲羟戊酸（ mevalonate）含量高效液相层析-串联质谱法定量检测试剂盒
产品说明书

主要用途
体液甲羟戊酸（mevalonate）含量高效液相层析-串联质谱法定量检测试剂是一种旨在通过物理裂解和有机 溶剂萃取，进而在高效液相色谱仪和质谱仪下检测分析，分离出甲羟戊酸离子波峰，以定量测定样品中甲 羟戊酸的含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种体液包括血 浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液，以及培养液、水制品等样品中甲羟戊酸的含量检测。产品严格无 菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
甲羟戊酸（mevalonate；MVA）是生物体中甲羟戊酸通路（mevalonate pathway）中的重要的有机化合物， 由3-羟-3-甲戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase；HMGR）催化3-羟-3-甲戊二酰 辅酶A转化为甲羟戊酸而生物合成，成为通路中的前体，主要是异戊二烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate； IPP）的前体，进一步合成类异戊二烯（isoprenoid）和固醇（steroids）等。许多降脂药物，包括lovastatin
（Mevacor）、atorvastatin  （Lipitor）、pravastatin（Pravachol）和simvastatin（Zocor）等，通过抑制HMG 还原酶的活性，达到降低甲羟戊酸的合成。由此甲羟戊酸的水平检测成为体内胆固醇水平和降脂药物活性 程度的生物标记。高效液相层析-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry；HPLC-MS/MS）技术是一种直接、敏感、快速检测甲羟戊酸含量的方法：首先物理裂解组织 细胞和有机溶剂萃取，进而在高效液相色谱仪下，分离出甲羟戊酸，然后在质谱仪中碰撞诱导产生有机分 子产物离子波峰，以定量甲羟戊酸的含量。

产品内容
缓冲液（Reagent A）        毫升
萃取液 A（Reagent B）    毫升
萃取液 B（Reagent C）    毫升
稀释液（Reagent D）    毫升
流相液 A（Reagent E）    毫升
流相液 B（Reagent F）    毫升
标准液（Reagent G）    微升
产品说明书        1 份

保存方式    
保存标准液（Reagent G）在-20℃冰箱里，其余的保存在 4℃冰箱里；试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖； 缓
冲液（Reagent A）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证 3 月

用户自备
2 毫升离心管：用于样品操作的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 （微型）台式离心机：用于样品处理
DOUNCE 匀浆器：用于裂解组织
干式恒温箱：用于样品挥干
高效液相色谱仪-串联质谱仪（HPLC-MS/MS）：用于样品定量测定

实验步骤
一、 样品准备
1 ． 准备好待测的液体样品
2 ． 移取 2 毫升到 15 毫升锥形离心管
3 ． 加入 xx 毫升缓冲液（Reagent A），混匀
4 ．室温下孵育 2 小时
5 ． 加入 3 毫升萃取液 A（Reagent B）
6 ． 涡旋震荡 1 分钟
7 ． 加入 xx 毫升萃取液 B（Reagent C）
8 ． 涡旋震荡 2 分钟
9 ． 冰槽里静置 10 分钟
10 ．放进微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 14000g
11．移取上层液相到新的 2 毫升离心管
12 ．放进 40℃干式培养箱挥干
13 ．加入 xx 微升稀释液（Reagent D），混匀，避免光照
14 ．即刻进行后续高效液相色谱和质谱分析

二、 测定准备
1 ． 开启仪器预热 15 分钟
2 ． 根据下表设置高效液相色谱仪（HPLC）参数
参数    推荐                    补充说明
色谱柱    长度：10 cm
    直径：4.6 mm                Waters 仪器或 Agilent 仪器
固定相    C18    
流动相    流相液 A（Reagent E）和流相液 B（Reagent F）    参见运行程序
流速    0.5 毫升/分钟    
注射容量    10 微升    
柱温    20℃    
运行时间    16 分钟                    参考
液相检测    204nm    
监测    质谱仪    


3 ． 运行程序
运行时段        程序                            时间
开机后预运行    100%  流相液 A（Reagent E） 0%  流相液 B（Reagent F）        总 10 分钟
检测运行时段    100%  流相液 A（Reagent E）至 80%流相液 A（Reagent E）        0 至 4 分钟
        80%流相液 A（Reagent E）至 0%  流相液 A（Reagent E）        4 至 12 分钟
        0%  流相液 A（Reagent E）                    12 至 14 分钟
        0%  流相液 A（Reagent E）至 100%  流相液 A（Reagent E）        14 至 14.2 分钟
        100%流相液 A（Reagent E）                    14.2 至 24 分钟
关机前运行    100%  流相液 A（Reagent E） 0%流相液 B（Reagent F）        总 10 分钟

4 ． 根据下表设置串联质谱仪（MS/MS）参数
参数        推荐                            补充说明
质谱仪流速    0.5 毫升/分钟    
质谱仪模式    负电喷雾离子化模式（negative electrospray ionization mode）    
气体使用        雾化气体（nebulizing gas）：氮气 碰撞气体（collision gas）：氩气    
碰撞压力        0.5 mTORR    
离子喷雾电压    3000 伏    ion spray voltage
毛细管温度    350℃    
监测模式        多反应监测模式（multiple reaction monitoring (MRM) mode）    
母离子（PARENT     
ION）质荷比（M/Z）    147. 1        碰撞诱导碎片离 （collision-induced fragment ion）
产物离子            59. 1                碰撞诱导碎片离
（PRODUCT ION）        （collision-induced
质荷比（M/Z）        fragment ion）
碰撞能量            14 eV                    COLLISION ENERGY
峰值时间（retention）    3.5 分钟                        参考

三、 标准样品配制
1 ． 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管
2 ． 分别加入 xx 微升稀释液（Reagent D）到 1 至 5 号管
3 ． 移取 xx 微升标准液（Reagent G）到 1 号管，混匀
4 ． 小心移取 xx 微升 1 号管稀释的标准液（Reagent G）到 2 号管，混匀
5 ． 小心移取 xx 微升 2 号管稀释的标准液（Reagent G）到 3 号管，混匀
6 ． 小心移取 xx 微升 3 号管稀释的标准液（Reagent G）到 4 号管，混匀
7 ． 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

管号    稀释液（Reagent D）    标准液（Reagent G）    标准甲羟戊酸浓度
1    xx 微升            xx 微升            50 微摩尔/升
2    xx 微升            xx 微升 1 号管        25 微摩尔/升
3    xx 微升            xx 微升 2 号管        12.5 微摩尔/升
4    xx 微升            xx 微升 3 号管        6.25 微摩尔/升
5    xx 微升            0            0  微摩尔/升

8 ． 置于冰槽里备用

四、质谱分析
1 ． 分别移取 xx 微升上述制备的标准液（Reagent G）和待测样品
2 ． 每次（每个样品）注射 10 微升
3 ． 每次（每个样品）运行 24 分钟
4 ． 获得质谱图：基峰读数（relative intensity；RI 或 cps），保存记录
5 ． 全部运行完成，使用30 毫升无离子水清洗色谱柱

五、计算含量
1 ． 方法一：通过仪器中的软件进行测算
2 ． 方法二：构建 MRM 标准曲线：纵座标（Y 轴）为基峰读数（relative intensity；RI 或 cps）；横座标（X 轴）为标准甲羟戊酸浓度（微摩尔/升），根据标准曲线获得样品对应甲羟戊酸浓度（微摩 尔/升）
实际样品浓度：样品对应甲羟戊酸浓度（微摩尔/升） ÷ 40
3 ． 方法三：公式计算（选择单一浓度的标准液）
样本甲羟戊酸浓度（微摩尔/升）={【样本基峰读数（relative intensity；RI 或 cps）X 标准甲羟戊酸浓度（微 摩尔/升）】÷对应标准甲羟戊酸浓度的基峰读数}÷40

注意事项
1 ． 本产品为 20 次操作
2 ． 本产品检测限值是 1 微摩尔/升甲羟戊酸
3 ． 操作时，须戴手套
4 ． 试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖或使用封口膜
5 ． 缓冲液（Reagent A）具有腐蚀性，注意操作安全
6 ． 色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等
7 ． 用户可以使用已知浓度的标准液（Reagent G）作为内参标准加入到样品中，检测回收率（recovery）
8 ． 甲羟戊酸 MRM 质谱（M/Z147. 1/59. 1 Da）参考图谱如下
9 ． 甲羟戊酸的出峰时间（retention）以用户操作时，使用的标准液（Reagent G）实际出峰为准
10 ．本公司提供系列甲羟戊酸通路检测试剂产品

质量标准
1 ． 本产品经鉴定性能稳定
2 ． 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后， 应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证 说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告） 与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作 所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组份订购信息
编号                       名称                        规格
G&VS50634.4       体液甲羟戊酸含量高效液相层析-串联质谱法定量检测试剂盒     20 次
G&VS50634.4A     缓冲液（Reagent A）                    毫升
G&VS50634.4B     萃取液 A（Reagent B）                 毫升
G&VS50634.4C     萃取液 B（Reagent C）                 毫升
G&VS50634.4D     稀释液（Reagent D）                 毫升
G&VS50634.4E      流相液 A（Reagent E）                毫升
G&VS50634.4F       流相液 B（Reagent F）                 毫升
G&VS50634.4G    标准液（Reagent G）                微升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                            规格
G&VS50634. 1    通用性甲羟戊酸（mevalonate）含量高效液相层析-质谱法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50634.2    细胞甲羟戊酸（mevalonate）含量高效液相层析-质谱法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50634.3    组织甲羟戊酸（mevalonate）含量高效液相层析-质谱法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50634.4    体液甲羟戊酸（mevalonate）含量高效液相层析-质谱法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50634.5    细菌甲羟戊酸（mevalonate）含量高效液相层析-质谱法定量检测试剂盒    20 次