兔原代半月板纤维软骨细胞说明书

 种属：兔
 组织来源：半月板组织
 形态特征：梭 状 细 胞 样 ，不规则细胞样  
生长特征：贴壁生长
产品规格：5×105cells/T25培养瓶
传代比例/细胞消化：1:2传代                   
倍增时间：每周2 至 3 次                    
换液频率：2-3天换液一次

完全培养基配置：基础培养基500ml；生长添加剂5ml；胎牛血清50ml；双抗5ml 完全生长试剂盒货号:JW-C907
培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
冻存条件：冻存液：90%FBS，DMSO 10%,或使用非程序冻存液
细胞检测：Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ)免疫荧光染色为阳性。经鉴定细胞纯度高于90%。不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
产品使用：仅限于科学研究 ，不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用                                          
简介/背景：半月板作为膝关节的重要结构部分，具有稳定膝关节、维持运动协调，吸收震荡、承 载及分散负荷，润滑关节、增加关节接触面等功能，半月板承受着至少50%的膝关节 压力，是膝关节运动损伤中比较常见的损伤部位。
半月板主要由纤维软骨细胞和大量基质构成，随着年龄的增长，细胞成分含量减少。

细胞接收处理流程：
1、请显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×,20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时 细胞状态的依据。
2、收到细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，不开瓶盖放培养 箱静置2-3小时稳定细胞状态。
3、镜下观察：未超过80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，重新加入6ml完全培养基，放入37℃、5%CO2培养 箱培养；超过80%汇合度时，根据情况传代或者冻存。
4、悬浮细胞需离心收集处理。抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心3-5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照 说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。
（注意： 若发货的是密封培养瓶，处理完后放入培养箱培养，记得培养瓶盖子拧松，初次传代最好使用T25培养瓶或6cm小皿1传2）

细胞培养步骤
1、复苏细胞： 将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。1000RPM条件下离心3-5 分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿 中培养过夜），第二天换液并检查细胞密度。
2、细胞传代： 如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

悬浮细胞，传代可参考以下方法：
步骤一 ：收集细胞，1000RPM条件下离心3-5分钟，弃去上清液， 补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的 含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
步骤二：较脆弱的悬浮细胞可选择半数换液方式将培养瓶竖置1-2 小时待大部分细胞沉到底部后，弃去半数培养基，将剩余细胞悬   起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中 或者瓶中。
步骤三：细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴 壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进 行离心收集，1000RPM条件下离心3-5分钟，去除上清，按冻存数 量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

贴壁细胞，传代可参考以下方法：
步骤一 ：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
步骤二：加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养 瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞  消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几    下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
步骤三：轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出悬液至15ml离心管中，在 1000RPM条件下离心3-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后  吹匀。
步骤四：将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6ml培养液的 新皿中或者瓶中。


特殊细胞收到注意事项
部分细胞由于贴壁不牢在运输过程中发生细胞脱落，这是正常现象，正确处理后都可以正常生长。
1、将培养瓶内所有培养基转   入无菌离心管，离心收集细胞（1200rpm3-5min）去除旧培养基；
2、用PBS重悬细胞，将所有细胞收集到一个离心管中，再次离心（1200rpm3-5min）去除PBS；
3、加入1ml左右0.25%胰酶重悬细胞，混匀即可，不能吹打太多次，放入培养箱消化，根据细胞特性决定消化时间（约1~2分钟）；
4、消化好后，用移液枪轻轻吹打细胞悬液，使细胞团分散，迅速加入3-5ml完全培养基混匀以终止消化，离心（1200rpm3-5min） 去除胰酶；
5、加入5ml左右细胞相应的完全培养基混匀，按比例接入无菌培养瓶/皿中；
6、显微镜下观察看细胞是否成均匀分散的单颗细胞，若有3-5个成团的小细胞团可不用重新消化，使之贴壁，待细胞生长稳定后再 消散细胞。