氨基酸( AA)含量检测试剂盒说明书微量法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：
试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入 1mL 无水乙醇，盖紧后充分混匀，再加入 14mL 蒸馏水混匀，避光保存。
试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水，充分溶解。
标准品：粉剂×1 支，10mg半胱氨酸，4℃避光保存。临用前加入 8.26mL 蒸馏水，得到 10µmol/mL 的半胱氨酸标准溶液备用。

产品说明书：
动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，故尿中氨基酸的变化最能反应肝、肾的生理状态。 另外，氨基酸还能反应灼伤、伤寒等方面情况。植物体内氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不 同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意义。
氨基酸的α-氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，在 570 nm 有特征吸收峰；通过测定 570 nm 吸光度，来计算氨基酸含量。

试验中所需的仪器和试剂：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研 钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、样品的提取：
1.     组织样本：称取约 0.1g 组织，加试剂一 1mL ，室温下充分研磨，转移到 1.5 mL EP  管中，盖紧 后（防止水分散失）置于沸水浴提取 15 min；自来水冷却后，10000rpm ，4℃离心 10min ，取上 清液，待测。
2.    细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），盖紧后（防 止水分散失）置于沸水浴提取 15min；10000rpm ，4℃离心 10min ，取上清液，待测。
3.    液体：吸取 0.5mL 液体加入 0.5mL 提取液，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴提取 15 min； 自来水冷却后，10000rpm ，4℃离心 10min ，取上清液，待测。

二、测定步骤：
1 、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm ，蒸馏水调零。
2、操作表：（在 EP 管中进行）
试剂名称 (µL）    测定管    标准管    空白管
样本        10    —    —
标准品        —    10    —
蒸馏水        —    —    10
试剂二        100    100    100
试剂三        100    100    100
试剂四        10    10    10
混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温 15 min ，冷却后反复颠倒 EP 管数次， 8000rpm 离心 5min 后取上清，于 570nm 测定吸光值，分别记为 A 测定管、A 标准管、A 空白管， 并计算∆A 测定管=A 测定管-A 空白管，∆A 标准管=A 标准管-A 空白管，显色后务必在 30min 内测 完。

氨基酸含量计算：
（1） 按样本鲜重计算
氨基酸含量 (µmol /g 鲜重）
=（C 标准品×V 标准品×∆A 测定管÷∆A 标准管）÷（W÷V 样总÷V 样） = 10×∆A 测定管÷∆A 标准管 ÷W
（2） 按蛋白浓度计算
氨基酸含量 (µmol /mg prot ）=（C 标准品×V 标准品×∆A 测定管÷∆A 标准管）÷（Cpr×V 样） = 10×∆A 测定管÷∆A 标准管 ÷Cpr
（3） 按细菌或细胞数量计算
氨基酸含量 (µmol/104  cell) =[C 标准品×V 标准品×∆A 测定管÷∆A 标准管]÷（500×V 样÷V 样总） =0.02×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)
（4） 按液体体积计算
氨基酸含量 (µmol /mL）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×2
= (A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)
C 标准品：标准品浓度，10µmol/mL；V 标准品：反应体系中加入标准品体积，0.01 mL；W：样 品鲜重，g；V 样：反应体系中加入样品体积，0.01mL；V 样总：样品提取液总体积，1mL；Cpr： 上清液蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500 万个；2 ：提取液体时的稀释倍数，（V 液体+V 提取）/V 液体=2。

注意事项：
1.    试剂盒中试剂三和试剂四均需临用前配制，且避光保存。
2.    为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于 1.5），用 蒸馏水稀释后再测定。
3.    脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应在 570nm 处无吸收峰，因此，570nm 处测定结果不含这两种氨 基酸的量。
4.    如果测定数值较小，可适当增加组织或细胞的样本量，液体样本可调整和提取液的比例（如将 0.5mL 液体+0.5mL 提取液改为 0.7mL 液体+0.3mL 提取液）