CAT#:JW-15-00003 低温运输,-20℃保存

人端粒酶活性检测试剂盒（探针法 TRAP）                             

产品及特点：
端粒酶存在于 85-90%的肿瘤组织中 ， 因此通过检测端粒酶活性就有可能早期诊断大多数肿瘤 。 目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是 TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol ， 端粒重复片段扩增) ， 它利用端粒酶能在底物 DNA 末端添 加不同数量的 TTAGGG 序列这一特点 ，通过 PCR 检测延伸产物而高效检测端粒酶活 性 。但是传统的 TRAP 方法为终点电泳检测法 ，灵敏度低 ，没法定量 ， 同时还容易产 生气溶胶污染 。为克服这些缺点 ， 本公司开发了基于探针法 qPCR 的 TRAP 试剂盒 。 它具有以下特征：
1.   即开即用 ，提供从细胞裂解到 qPCR 所有试剂 ，免去自己优化条件。
2.   基于探针法荧光定量 PCR ， 比电泳法 TRAP 灵敏度高。
3.   使用探针 ，专一性比电泳法 TRAP 高。
4.   提供阳性对照 ，可以进行基于此对照的定量分析。
5.   一管式操作 ，免去气溶胶污染之忧。
6.   既可用于定量 ，又可用于定性 。 用于定量时线性范围至少有 5 个数量级。
7.   既可用于培养细胞 ，也可用于实体组织（包括肿瘤组织）。
8.   本产品足够 50 次 20uL 体系的 TRAP PCR 检测。
9.   本产品只能用于科研。

规格及成分                                  
本产品采用小扁盒包装
编号            编号        规格    包装
TRAP 专用细胞裂解液        15-00003a        10 mL    10mL 本色瓶
2×TRAP 专用 qPCR MasterMix    15-00003b    0.5mL    0.5mL 本色盖
荧光 PCR 模板专用稀释液    180701        1.0mL    1.5mL 绿色盖
人 TRAP 检测阳性对照
（ 10E7 拷贝/μL）        pd 15-00003dx-10    50 μL    0.5mL 黄色盖
人端粒酶底物溶液        yw15-00003dx    50 μL    0.5mL 白色盖
人 TRAP 引物-探针混合液    yp15-00003    150 μL    1.5mL 棕色管
超纯水            210806        1 mL    1.5mL 蓝色盖
使用手册            15-00003sc    1份    无

运输及保存：低温运输 ，-20℃保存 ，有效期一年。
自备试剂：BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ， 固相 RNase 清除剂

使用方法
一 ：标准曲线样品的制备
以阳性对照浓度为 10E2-10E6 拷贝/μL 这 5 个 10 倍稀释度为例 。 由于标准品 浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ， 不能污染样品或本试剂盒的其他成分。
1.   标记 6 个离心管 ，分别为 6 ， 5 ， 4 ， 3 ，2。
2.   在 2-6 号管中加入 45μL 荧光 PCR 模板专用稀释液。
3.   在 6 号管中加入 5 μL  1 × 10E7 拷贝/μL 的人 TRAP 检测阳性对照(试剂盒提 供) ，充分震荡 1 分钟 ，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。
4.   换枪头 ，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟 ，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。
5.   换枪头 ，在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟 ，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。
6.   重复上面的操作直到得到 5 个稀释度的标准曲线阳性样品 。放冰上待用。

二 ：端粒酶的提取
注意 ：端粒酶的组成成分中有 RNA ，极容易被降解 ， 因此 ，提取端粒酶应该跟提 取 RNA 一样 ，尽量在低温条件下快速操作、 最好使用本公司的固相 RNase 清除 剂预先清洁试验台面等容易有 RNase污染的地方。
7.   对冷冻的实体组织 ：将 50-100mg 在-80℃冷冻的组织放装有液氮的研钵中研磨 成粉末 ，再转移到预冷的玻璃匀浆器中 ， 加入 200μL 预冷的 TRAP 专用细胞裂 解液 ，温和手动匀浆 6 次后冰浴 30 分钟 ，每间隔 5 分钟涡旋振荡一次 ，然后直 接进入第 10 步操作。
注意 ：为保证裂解效果 ，可在显微镜下观察确保大部分细胞已经裂解 。如果组织 样品不足 50-100mg ，可以按比例降低 TRAP 专用细胞裂解液用量 。在-20℃保 存的实体组织放置 2 个月后就失去端粒酶活性 ，而在-80℃保存的实体组织放置 数年还有端粒酶活性。
8.   对新鲜的培养细胞和组织： 用自备的预冷 PBS 洗涤 10E6 个经过胰酶处理的细 胞或 50-100mg 经过胰酶处理的新鲜组织 ， 3000g 4 ℃离心 5 分钟 ， 弃上清 ， 细胞沉淀可以直接使用 ， 也可以放-80℃保存后续使用 。在细胞或组织沉淀中加 入 200μL 预冷的 TRAP 专用细胞裂解液 ， 轻柔吹打 3 次悬浮细胞或组织 。对新 鲜细胞： 涡旋振荡 10 秒后置冰浴 30 分钟 ，每间隔 5 分钟涡旋振荡一次 。对新 鲜组织 ：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴 30 分钟 ，每间隔 5 分钟涡旋振荡 一次 。如果细胞不足 1 × 10E6 或 50-100mg ，按比例降低 TRAP 专用细胞裂解 液用量。
9.    14000g 4 ℃离心 20 分钟 ，收集 160μL 上清（含端粒酶）， 留 40μL 不取。
10. 取部分上清液用自备 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。
11. 测出各样品的蛋白浓度后 ， 用 TRAP 专用细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成 3μg/μL ，然后分装合适的量到离心管中 ，将实验所需的数量放冰上待用 ，其余的 放-80℃长期保存（可存放一年）。此步所得样本称为端粒酶待测样本。
12. 对每个样本 ，一次实验需要两管 ，一管用于测定端粒酶活性 ，一管用作该待测样 本的热灭活阴性对照 。 制备方式是每个样本取一管端粒酶待测样本 ， 95℃处理
10 分钟灭活端粒酶 ， 放冰上待用 。 没有用完的可放-80℃长期保存（可存放一 年）供下次使用。

二 ：探针法 TRAP（ 20uL 体系）
13. 确定端粒酶待测样本的 ：为便于比较 ，每个反应所用的蛋白量总量（或对应的细 胞数）必须一样 ，否则不好进行样本间的比较。
14. 设置反应 。如果有 N 个样品 ，每个样品做 1 次重复（一般建议作三个重复 ， 此处 为表述方便 ，假设只做 1 次重复）， 则需要准备 2N+6 个反应管 。 多 1 倍是因为 每个样本都需要一个对应的热灭活阴性对照 。另外 1 个用作探针法 TRAP 阴性对 照 ，最后 5 个用于标准曲线样本 。

三 ：结果分析
16. 实验的有效性判断 ：如果标准曲线样本管的 FAM 信号结果为阴性（无 Ct 值 ， 或 者大于或等于 40），则整个实验无效 ， 不需要分析数据 ， 需要重复实验或跟厂家 联系 。 如果探针法 TRAP 阴性对照管的 FAM 信号结果均为阳性（有 Ct 值小于 40），说明环境污染 ， 则整个实验无效 ， 不需要分析数据 ， 需要跟厂家联系 。如 果标准曲线样本管的 FAM 信号结果为阳性 ，探针法 TRAP 阴性对照管的结果为 阴性 ，则实验有效 ，可以进入下步分析。
17. 标准曲线制作： 以 5 个标准曲线样本浓度的 log 值为横轴 ， 以阳性对照（ FAM 通 道） 的 Ct 值为纵轴 ，绘制标准曲线 ， 阳性对照的标准曲线为斜线 ，r2 必须大于 0.95 。再以待测端粒样品的 Ct 值从阳性对照的标准曲线上推算出待测端粒酶所 合成的端粒重复序列的拷贝数的 log 值 ，再有此 log 值推算出新合成的端粒重复 序列拷贝数 。 由于新合成的端粒 DNA 重复序列的拷贝数跟端粒酶的活性相关 。 因此端粒酶活性大小跟测试的 Ct 呈现反相关 ， 同一次实验所得的 Ct 值可以用来 比较各所测各样本中端粒活性的相对大小。

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