仅供科研实验研究使用，不得用于临床检验。

人碱性磷酸酶（ALP）ELISA 检测试剂盒说明书

试剂盒组成
名称        48 孔配置        96 孔配置        保存条件
微孔酶标板    12 孔×4 条    12 孔×8 条    4℃
标准品        0.3mL        0.3mL        4℃
样本稀释液    3mL        6mL        4℃
检测抗体-HRP    5mL        10mL        4℃
20×洗涤缓冲液    15mL        25mL        4℃
底物 A        3mL        6mL        4℃
底物 B        3mL        6mL        4℃
终止液        3mL        6mL        4℃
封板膜        2 张        2 张        无
产品说明书    1 份        1 份        无
自封袋        1 个        1 个        无
备注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、15、30、60、120、240 IU/L

检测原理
极威生物ELISA 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验 （ELISA）。往预先包被碱性磷酸酶（ALP）抗原的包被微孔中，依次加入标本、 标准品、HRP 标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物 TMB 显色，TMB 在 过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的 深浅和样品中的碱性磷酸酶（ALP）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸 光度（OD 值），计算样品活性。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集 血液后，3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟取上清。
5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃ , 避免 反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试验所需自备试验器材 (不提供，但可协助购买)
1. 酶标仪(450nm 波长滤光片)
2. 进 口 品牌高精度加 液器及一次性吸头：0.5-10ul, 2-20ul, 20-200ul, 200-1000ul。
3. 37℃恒温箱, 双蒸水或去离子水，坐标纸等。可协助代购相关产品，请咨询。

操作注意事项
1. 试剂盒保存在2-8℃ , 使用前室温平衡 60 分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会 有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。样本在使用前 也要在室温平衡 60 分钟。
2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3. 预处理后的样本无需稀释，直接取 10μL 加样即可。
4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5. 所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1：20 稀释，即 1 份的20×洗涤缓冲液 加 19 份的蒸馏水。

注意事项
1. 试剂盒使用前请保存在 2-8 ℃ 。复溶后的标准品若未用完，请废弃。
2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使 液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或 1000 转/分离心 1 分钟，以 使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前， 请用移液器小心吹打 4-5 次使 溶液混匀。
3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结 晶完全溶解后再配制洗涤液。（加热温度不要超过 50 ℃)  使用时洗涤液应为 室温。
4. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。请提前咨询 极威生物科技有限公司。
5. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)， 如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
6. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。
7. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否 则将影响试验结果。
8. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他 体液标本时，请按国家生物试验室安全防护条列执行。
9. 如果分次使用，请根据需要量配制各组分，以免配制过多造成浪费而影响后 续试验。剩余板孔请用封板胶纸封住，放回铝箔袋中,2 个月内用完。

标准品稀释方法图例
以 500 ul/管为例，用标准品&标本通用稀释液将复溶后的标准品母液进行 倍比稀释，具体稀释方法如下图，也可根据实际用量来稀释，如 200 ul/管。

洗板方法
1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽孔内液体， 在吸水纸上拍干，如此洗板 5 次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液 350 μL，浸泡 1min，洗板 5 次。

操作步骤
1. 从室温平衡 60min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μL；
3. 待测样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液 40 μL；
4. 随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水 纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入终止液 50 μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

结果判断
1. 每个标准品和标本的OD 值应减去空白孔的OD 值。
2. 以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线。 通过标本的OD 值可在标准曲线上查出其浓度。
3. 若标本 OD 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀 释倍数

试剂盒性能
1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数 R 值，大于等于 0.9900。
2. 灵敏度：最低检测浓度小于 1.0 IU/L。
3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性：板内变异系数小于 10%、板间变异系数小于 15%。
5. 贮藏：2-8℃ , 避光防潮保存。
6. 有效期：6 个月

免责声明
1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后
果，由实验者承担，本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。