诺氟沙星（Norfloxacin） ELISA 检测试剂盒使用说明书

检测原理
试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被诺氟  沙星（Norfloxacin）抗原的包被微 孔中，依次加入标本、标准品、HRP  标记的竞争抗原， 经过温育并彻底洗涤。 用底物TMB显色，TMB在过  氧化物酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的诺氟沙星（Norfloxacin） 呈负相关。 用酶标仪  在450nm  波长下测定吸光度（OD  值）， 计算样品浓度。
样品收集 、 处理及保存方法
1.    样本不能含叠氮钠（NaN3）， 因为叠氮钠（NaN3） 是辣根过氧化 物 酶（HRP） 的抑制剂。
2.    标本采集后尽早进行提取， 提取按相关文献进行。
3.    植物萃取液或其它相关样本： 请1000 x g离心20分钟， 取上清即 可检测。 花生样本处理方法： 样本去壳粉碎， 称取5g于100ml具塞三 角瓶中， 加入25ml 60%甲醇谁溶液和20ml正乙烷振荡10min， 滤纸过 滤 ，弃去1/4初滤液 ，收集其余滤液于125ml分液漏斗中，静置分层后 放出下层60%甲醇水提溶液。现提取液2ml ，加入2ml超纯水稀释 ，使 提取液甲醇浓度为30%， 此为样品代测液。
4.    保 存： 如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装 ，冻 存于 -20℃ ,   避免反复冻融， 在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品
1.  酶标仪（450nm）
2.  高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.  37℃恒温箱

操作注意事项
1.      试剂盒保存在 2-8℃ ,    使用前室温平衡 20  分钟。 从冰箱取出的 浓缩洗涤液会有结晶， 这属于正常现象， 水浴加热使结晶完全溶解
后再使用。
2.      实验中不用的板条应立即放回 自 封袋中， 密封（ 低温干燥） 保 存。
3.      按照说明书操作时样本已经稀释 5  倍， 最终结果乘以 5 才是样 本实际浓度。
4.      严格按照说明书中标明的 时 间 、 加液量及顺序进行温育操作。
5.      所有液体组分使用前充分摇匀。 试剂盒组成

名称        96孔配置        48孔配置        备注
微 孔酶标板    12孔×8  条    12孔×4  条    无
标准品        0.3mL *6 管    0.3mL *6 管    无
样本稀释液    6mL        3mL        无
竞争抗原-HRP    6mL        3mL        无
20×洗涤缓冲液    25mL        15mL        按说明书进行稀释
底物 A        6mL        3mL        无
底物 B        6mL        3mL        无
终止液        6mL        3mL        无
封板膜        2 张        2 张        无
说明书        1 份        1 份        无
自 封袋        1 个        1 个        无
注： 标准品（ S0-S5） 浓度依次为 ：0 、0.375 、0.75 、 1.5 、3 、6 ppb

试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释 ：蒸馏水按 1：20 稀释 ，即 1 份的 20×洗涤缓 冲液加 19 份的蒸馏水。
洗板方法
1. 手工洗板 ：甩尽孔内液体 ，每 孔加满洗涤液， 静置 1min 后甩尽 孔内液体， 在吸水纸上拍干， 如此洗板 5 次。
2. 自 动洗板机： 每 孔注入洗液 350 μ L， 浸泡 1min， 洗板 5  次。

操作步骤
1. 从室温平衡 20min  后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自 封 袋密封放回 4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μ L；
3.样本孔先加待测样本 10 μ L， 再加样本稀释液 40 μ L； 空 白 孔不  加。
4. 除 空 白 孔外， 标 准 品 孔和样本 孔 中 每 孔加入辣根 过 氧 化物酶 （ HRP） 标记的竞争抗原 50 μ L， 用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。
5. 弃去液体， 吸 水纸上拍干， 每 孔加满洗涤液， 静置 1min， 甩去 洗涤液， 吸水纸上拍干， 如此重复洗板 5 次（ 也可用洗板机洗板）。
6. 每 孔加入底物 A 、B 各 50 μ L，37℃避光孵育 15min。
7. 每 孔加入终止液 50 μ L ，15min  内， 在 450nm  波长处测定各孔的 OD 值。

结果判断
1. 15分钟内在波长450nm的 酶标仪上读取各孔的OD值；
2. 百分结合率计算：设S0管计数为B0，各标准管或样品管计数为B， 非 特 异 管 计 数 为 NSB ， 则 百 分 结 合 率 计 算 公 式 如 下 ： B/B0=(B  -   NSB)/(B0－NSB)×100%
3. logit  计  算  :   各  标  准  点  或 样  品  管  的  logit  值  计  算  公  式   如 下:logit=ln(B/B0)/(1－B/B0)
4. 将标准品的OD均值与标准品0点的OD均相除，为标准点的百分结 合率， 在log-logit坐标纸上绘图。
5. Log-logit双对数标准曲线： 坐标纸上横轴从左至右第一个1-9表  示为第一个10进位， 第二个1-9表示为第二个10进位。 第三个1-9表  示为第三个10进位。 坐标纸纵轴为百分比（1-99）， 即各标准吸光值  的 百分结合率。 取一条通过各点的直线。 要求尽可能多的点在线上， 同 时剩余的点均匀分布在直线的两边。 样 品 也 同样由吸光值计算百  分结合率， 再从纵轴上的相应结合率找到直线上的点， 此点对应的  横坐标浓度即为样品的浓度， 无须换算。
6. 人工处理：以标准浓度取log值为横坐标 ，对应的logit值为纵坐标  在 普通坐标纸上或以 标 准浓度 为横坐标， 对应的B/B0为纵 坐标在  logit-log坐标纸上画出标准曲线（ 理想化时是一条直线）。根据待测样  品的B/B0可以从坐标纸上查出样品的浓度值。 如果使用普通坐标纸， 查出的数值应取反对数才是最后的浓度值。
7. 自 动处理： 使用logit-log或四参数数据处理模式， 由 电脑自 动计 算得出结果。
8. 敏感度 ：0.25 ppb
9. 图例

试剂盒性能
1.      准确性： 标准品线性回归 与预期浓度相关系数 R 值， 大于等于 0.9900。
2.      灵敏度： 最低检测浓度小于 0.25ppb。
3.      检测范 围: 0.1 - 6 ppb。
4.      特异性： 不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
5.      重复性： 板 内 、 板间变异系数均小于 15%。
6.      贮藏 ：2-8℃ ,    避光防潮保存。
7.      有效期：6 个月

免责声明
1.      试剂盒仅供研究使用， 不得用于临床实验或人体实验， 否则所 产生的一切后果， 由实验者承担， 本公司概不负责。
2.      严格按照说明书操作， 实验者违反说明书操作， 后果由实验者 承担。