谷氨酸(Glu)含量检测试剂盒说明书

紫外分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格：50T/48S

产品内容:
试剂一：液体 100mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 5mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂 × 1 瓶，-20℃保存，临用前加入 40mL 试剂一；
试剂四：粉剂× 1 瓶，-20℃保存，临用前加入 2.5mL 试剂二；
标准品：液体 0.5mL× 1 支，4℃保存。10μmol/mL 谷氨酸标准品。

产品说明:
Glu 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，不仅是组成蛋白质的 20 种氨基酸之一，而 且通过转氨基作用参与多种氨基酸合成，是生物体内主要氨基来源之一。此外，Glu 还是味精的主 要有效成分，常用做食品添加剂以及香料生产。谷氨酸脱氢酶 (GDH) 催化谷氨酸和 NAD 生成α-酮戊二酸、NADH 和 NH4+  ，引起 340nm 处吸光度的上升，通过测定 340nm 吸光度的变化，计算谷氨酸含量。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

操作步骤：
一、谷氨酸提取
细菌、细胞或组织样品：收集细胞或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞 加入 1mL 试剂一，超声波破碎细菌或细胞 (功率 20％，超声 3s ，间隔 10s，重复 30 次)，10000rpm ，常 温离心 10min ，取上清待测。
称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆，10000 rpm ，常温离心 10min ，取上清待测。

二、测定步骤
1 、紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。
2 、标准溶液的制备
将标准品分别稀释为 2.5 、1.25 、0.625 、0.313 、0. 156 、0.078 、0.039μmol/mL 的标准溶液。 3 、在 1 mL 石英比色皿中加入下列试剂：
a.        标准管：在 1 mL 石英比色皿中加入 200μL 标准溶液、800μL 试剂三和 50μL 试剂四混匀， 立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值为 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2 ，计算∆A=A2-A1。
b.        测定管：在 1 mL 石英比色皿中加入 200μL 样本、800μL 试剂三和 50μL 试剂四混匀，立即 记录 340nm 处 20s 时的吸光值为 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2 ，计算∆A=A2-A1。

三、谷氨酸含量计算
1 、标准曲线的绘制：
以谷氨酸含量 (µmol/mL) 为 x 轴，标准管∆A 为 y 轴，绘制标准曲线 y=kx+b 。将测定管∆A 带 入方程得到 x 值。
2 、氨基酸含量计算：
(1) 按照蛋白浓度计算
谷氨酸含量 (µmol/mg prot) =x×V 样本÷   (Cpr×V 样本) =x÷Cpr。
(2) 按照样本鲜重计算
谷氨酸含量 (µmol/g 鲜重) =x×V 样本÷   (W÷V 样总 ×V 样本) =x÷W。
(3) 按照细菌或细胞数量计算
谷氨酸含量 (μmol/104 cell) ＝x×V 样本÷   (500÷V 样总×V 样本) =0.002x。
V 样总：加入提取液体积，1mL；V 样本：加入的样本体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本鲜重，g； 1000：细菌或细胞总数，1000 万。

注意事项：
为提高检测灵敏度，测定管的吸光值应小于 1 且∆A 小于 0.4 ，若大于此值则需要将上清液用试 剂一稀释至适当倍数后测定。