磺胺嘧啶（SD）ELISA 检测试剂盒使用说明书

检测原理
试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被磺 胺嘧啶抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的竞争 抗原，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的 催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深 浅和样品中的磺胺嘧啶（SD）呈负相关。用酶标仪在450nm 波长下 测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法
1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细 胞刺激，收集血液后，3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心 地分离。
2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。
3.  细胞上清液：3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。
4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟 取上清。
5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃ , 避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱

操作注意事项
1.   试剂盒保存在2-8℃ , 使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的 浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解 后再使用。
2.   实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保 存。
3.   按照说明书操作时样本已经稀释 5倍，最终结果乘以 5 才是样 本实际浓度。
4.   严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.   所有液体组分使用前充分摇匀。 试剂盒组成

名称        96 孔配置        48 孔配置        备注
微孔酶标板    12 孔×8 条    12 孔×4 条    无
标准品        0.3mL*6 管    0.3mL*6 管    无
样本稀释液    6mL        3mL        无
竞争抗原-HRP    6mL        3mL        无
20×洗涤缓冲液    25mL        15mL        按说明书进行 稀释
底物 A        6mL        3mL        无
底物 B        6mL        3mL        无
终止液        6mL        3mL        无
封板膜        2 张        2 张        无
说明书        1 份        1 份        无
自封袋        1 个        1 个        无
注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、3、6、12、24、48 PPb

试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1：20 稀释，即 1 份的20×洗涤 缓冲液加 19 份的蒸馏水。

洗板方法
1.   手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩 尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板 5 次。
2.   自动洗板机：每孔注入洗液 350 μL，浸泡 1min，洗板 5 次。

操作步骤
1.  从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自 封袋密封放回4℃。
2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μ L；
3.  样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液 40 μL；空白孔不加。
4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶 （HRP）标记的竞争抗原 50 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅 或恒温箱温育 60min。
5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去 洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。
6.  每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育 15min。
7.  每孔加入终止液 50 μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

结果判断
1.  15分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；
2.  百分结合率计算：设S0管计数为B0，各标准管或样品管计数为B， 非特异管计数为NSB ，则百分结合率计算公 式如下： B/B0=(B- NSB)/(B0－NSB)×100%
3.   log it 计 算 : 各 标 准 点 或 样 品 管 的 log it 值 计 算公 式 如 下: log it=ln(B/B0)/(1－B/B0)
4.  将标准品的OD均值与标准品0点的OD均相除，为标准点的百分结 合率，在log-log it坐标纸上绘图。
5.  Log-log it双对数标准曲线：坐标纸上横轴从左至右第一个1-9 表示为第一个10进位，第二个1-9表示为第二个10进位。第三个1-9 表示为第三个10进位。坐标纸纵轴为百分比（1-99），即各标准吸光 值的百分结合率。取一条通过各点的直线。要求尽可能多的点在线 上，同时剩余的点均匀分布在直线的两边。样品也同样由吸光值计 算百分结合率，再从纵轴上的相应结合率找到直线上的点，此点对应的横坐标浓度即为样品的浓度，无须换算。
6.  人工处理： 以标准浓度取log值为横坐标，对应的log it值为纵 坐标在普通坐标纸上或以标准浓度为横坐标，对应的B/B0为纵坐标 在log it-log坐标纸上画出标准曲线（理想化时是一条直线）。根据 待测样
品的B/B0可以从坐标纸上查出样品的浓度值。如果使用普通坐标纸， 查出的数值应取反对数才是最后的浓度值。
7.  自动处理：使用log it-log或四参数数据处理模式，由电脑自动 计算得出结果。
8.  敏感度：1.0 PPb
9.  图例

试剂盒性能
1.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数 R 值，大于等于 0.9900。
2.  灵敏度：最低检测浓度小于 0.1 PPb。
3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.  重复性：板内、板间变异系数均小于 15%。
5.  贮藏：2-8℃ , 避光防潮保存。
6.  有效期：6 个月

免责声明
1.   试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所 产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2.   严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者 承担。
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