植物 P 型 ATP 酶（P type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒
产品说明书

主要用途
植物 P 型 ATP 酶（P type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂是一种旨在使用P 型 ATP 酶、丙酮 酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在钒酸盐存在与否的情况下，受到 P 型 ATP 酶的水解产生的 ADP 过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后吸 光峰值（NADH 浓度）的变化，以此进行测算样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研 制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、 上胚轴（epicotyl）等 P 型 ATP 酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作 简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景
腺苷三磷酸酶，又称为ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATPphosphohydrolase；EC3.6. 1.3），属于  磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。ATP酶的去磷酸  化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白（transmembrane），帮助传输各种代谢分  子进出细胞。根据ATP酶的结构和功能，分为五类不同的ATP酶，即F、V 、A 、P和E型。P型ATP酶，又称  为E1-E2 ATP酶，通常由一条或两条多肽构成，且呈现两种主要的结构构象E1和E2。这类ATP酶存在于细菌  和真核细胞膜和细胞器上，其功能在于水解ATP获得能量，跨膜运输各种化学分子，包括离子和磷脂，例  如H+ 、Na+ 、K+ 、Mg2+ 、Ca2+ 、Ag+ 、Zn2+ 、Co2+ 、Pb2+ 、Ni2+ 、Cd2+ 、Cu2+等。P型ATP酶可以分成4种，Ca2+    传输性、Na+-K+ /H+-K+传输性、H+传输性和所有细菌型等。 基于ATP，在P型ATP酶抑制剂钒酸盐（vanadate） 存在与否的情况下，受到P型ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate   dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide； NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化   （340nm），来定量分析P型ATP酶的特异活性。其反应系统为：

产品内容    
清理液（Reagent A）           毫升
裂解液（Reagent B）           毫升
缓冲液（Reagent C）           毫升
酶促液（Reagent D）           微升
反应液 A（Reagent E1）     毫升
反应液 B（Reagent E2）     毫升
底物液（Reagent F）           毫升
阴性液（Reagent G）          毫升
专性液（Reagent H）           毫升
产品说明书        1 份

保存方式    
保存清理液（Reagent A）和反应液 B（Reagent E2）在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复 冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证 6 月

用户自备
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
DOUNCE 匀浆器：用于组织匀化
微型台式离心机：用于样品制备
培养箱：用于反应孵育
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度仪：用于光度分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然 后进行下列操作。
一、 样品准备（总蛋白制备）
1 ． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定组织重量
2 ． （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管
3 ． （选择步骤）加入适量的（1 克组织需要 3 毫升）清理液（Reagent A）清洗 1 次
4 ． 即刻用刀片切碎组织
5 ． 放进一个预冷的 15 毫升锥形离心管
6 ． 加入预冷的 xx 毫升裂解液（Reagent B）
7 ． 涡旋震荡 5 秒，充分混匀
8 ． 即刻放进预冷的 DOUNCE 匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约 80 下）
9 ． 将所有组织匀浆物移入 1.5 毫升离心管，放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 5000g（或 7500RPM ，例如 eppendorf 5415）
10 ．小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的 15 毫升锥形离心管
11．（选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心 5 分钟一次，速度为 5000g（或 7500RPM， 例如 eppendorf 5415）
12 ．即刻移入到 1.5 毫升离心管
13 ．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
14 ．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备
1 ． 准备好待测样品，置于冰槽里
2 ． 设定好分光光度仪（温度为28℃)：波长为 340nm ，间隔 5 分钟，读数 7 次（共 30 分钟），并置零
3 ． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定
1 ． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3 ． 加入 xx 微升反应液 A（Reagent E1）
4 ． 加入 xx 微升反应液 B（Reagent E2）
5 ． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）
6 ． 放进 28℃培养箱里静置 3 分钟
7 ． 加入 xx 微升阴性液（Reagent G）
8 ． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
9 ． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟

四、样品总活性测定
1 ． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3 ． 加入 xx 微升反应液 A（Reagent E1）
4 ． 加入 xx 微升反应液 B（Reagent E2）
5 ． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）
6 ． 放进 28℃培养箱里静置 3 分钟
7 ． 加入 50 微升待测样品（注意：100 微克总蛋白；样品须溶解）
8 ． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
9 ． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟

五、样品非特异活性测定
1.   移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2.   加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3.   加入 xx 微升专性液（Reagent H）
4.   加入 xx 微升底物液（Reagent F）
5.   放进 28℃培养箱里静置 3 分钟
6.   加入 50 微升待测样品（注意：100 微克总蛋白；样品须溶解）
7.   上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8.    即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟

六、 计算样品活性
1）样品活性（总活性和非特异活性）
单位＝微摩尔 NADH/分钟
2）样品特异活性

注意事项
1 ． 本产品为 21 次操作（10 个样本），包括背景对照测定
2 ． 操作时，须戴手套
3 ． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4 ． 建议使用质膜样品为佳（植物组织质膜（plasma membrane）分离试剂盒—G&VS16022）
5 ． 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、EDTA、EGTA 等，可以使用 SUCROSE 、IMIDAZOLE 等
6 ． 加入样品启动反应后3 秒内即刻光度测定
7 ． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续 30 分钟
8 ． 测定值由高到低变化，即 0 分钟测定读数高于 10 分钟或 30 分钟测定读数，表明有酶活性
9 ． 光度测定后，比色皿须清洗彻底
10 ．建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/50 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量； 注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 G&VS30030. 1）
11．样品特异活性是指钒酸盐敏感的 P 型 ATP 酶
12 ．P 型 ATP 酶活性单位浓度定义：在 28℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
13 ．本公司提供系列 ATP 酶类分析技术产品

质量标准
1 ． 本产品经鉴定性能稳定
2 ． 本产品经鉴定检测准确

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后， 应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证 说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告） 与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作 所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息

编号                                             名称                                                              规格
G&VS50246.5           植物 P 型 ATP 酶活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒        20 次
G&VS50246.5A         清理液（Reagent A）                                                        毫升
G&VS50246.5B         裂解液（Reagent B）                                                         毫升
G&VS50246.5C         缓冲液（Reagent C）                                                         毫升
G&VS50246.5D         酶促液（Reagent D）                                                         毫升
G&VS50246.5E    反应液 A（Reagent E1）                                             毫升
G&VS50246.5F    反应液 B（Reagent E2）                                             毫升
G&VS50246.5G    底物液（Reagent F）                                                   毫升
G&VS50246.5H    阴性液（Reagent G）                                                    毫升
G&VS50246.5I    专性液（Reagent H）                                                    毫升
G&VS30030. 1    Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒                                           200 次

试剂盒订购信息
产品编号                                                                名称                                                                规格
G&VS50246. 1    动物细胞 P 型 ATP 酶（P type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50246.2    动物组织 P 型 ATP 酶（P type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50246.3    细菌 P 型 ATP 酶（P type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒                20 次
G&VS50246.4    酵母 P 型 ATP 酶（P type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒                20 次
G&VS50246.5    植物 P 型 ATP 酶（P type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒                20 次