CAT#:JW-931042-25
低温运输，-20℃保存

miRNA 染料法 qRT-PCR 试剂盒（ polyA 加尾法）

产品及特点    
本试剂盒采用E.coli polyA聚合酶对miRNA加尾 ，然后用特异引物进行逆转 录 ，最后用荧光定量PCR试剂盒进行定量检测 ，其原理示意图如下：
本产品具有下列特点：
1.   两步法（加尾-逆转录、染料法 qPCR），一步完成加尾-逆转录 ，然后检测多
个 miRNA 靶分子 。一次加尾-逆转录反应得到的 cDNA 可以做上百次 PCR。
2.   直接用总 RNA 为模板 ，不需要专门纯化miRNA ，简单快捷。
3.   检测灵敏度可以达到几百个拷贝/反应。
4.   能区分有 2-3 个碱基不同的 miRNA。
5.   既可以定性 ，也可以定量 。定量时线性范围至少有 5 个数量级 ，但需要自备标准品。
6.   既可以用总 RNA 为模板 ，也可以用总 miRNA 为模板。
7.   用户需要自备 miRNA 专一性的一条 PCR 上游引物。
8.   本产品足够 25 次 20uL 体系的加尾和逆转录反应，100 次 20uL 体系的染料法qPCR。
9.   本产品只能用于科研。


规格及成分    本产品使用十孔盒包装
    
成分                                                                       编号                规格       包装材料    
加尾和逆转录Mix   （含 dNTP 和 ATP）             931042a        150 μL       0.5mL 绿盖管    
miRNA-polyA RT 引物                                         931042b        干粉            0.5mL 本色管
E.coli polyA 聚合酶和   M-MLV 逆转录酶混合液    931042c        40 μL       0.5mL 红盖管
miRNA PCR 通用下游引物                                    931042d        干粉            0.5mL 黄色管
2×SYBR PCR MasterMix                                      990408            1 mL       0.5mL 棕色管
超纯水                                                                   980403           1 mL           2.0mL 蓝盖管
使用手册                                                                931042sc        1 份                    无
注意：上表的两个引物用前需要加入 30uL 的超纯水充分溶解混匀后才可使用。

运输及保存：低温运输 ，-20℃保存 ，有效期一年。
自备试剂：总 RNA、miRNA 专一性上游引物（5pmol/μL in 水中）

使用方法    
一、 设计、合成和分析自备的 miRNA 专一性上游引物
1.   本试剂盒需要用户自行设计一条 miRNA 靶分子专一性的上游引物跟试剂盒提供的通用引物共同使用 ，用超纯水稀释到 5pmol/μL 待用。
2.   miRNA 专一性上游引物的 Tm 值决定后续 PCR 的复性温度 ，非常重要 ，故 必须准确。可以通过网上的在线分析软件（如 oligoanalyzer）计算Tm，但最 好实验测定 ，做法是将 100pmol miRNA 专一性上游引物和等量的互补引物 （不是下游引物） 在 20μL 的本试剂盒提供的 2×SYBR PCR MasterMix 反应 体系中混合（参考第 9 步 ，只是不加模板 ，其他成分都加） ，直接进行溶解 曲线分析， 测出在本试剂盒提供的反应体系中的 Tm 值 。当软件计算的Tm 值和实验测试的 Tm 值有差异时， 以后者为准。
3.   miRNA 专一性上游引物最好在 3 端比 miRNA 短几个碱基。
4.   可以选择一个所研究物种的 5.8S rRNA 作为内参 ，设计一条 5.8S rRNA 专一性的引物， 同时做平行实验。
二、 准备总 RNA
5.   用自选方法和试剂纯化总 RNA， 测定其浓度， 最后用超纯水将其稀释到 100ng/μL 。 总 RNA 样品 中残 留的 DNA 污染 由于 并没 有下 游通用 引物 （miRNA-polyA RT 引物） 的结合位点 ，所以一般不会干扰基于本方法的 miRNA PCR 检测。
三、 加尾及逆转录反应
6.   按下表设置 RNA 加尾和逆转录反应， 以 1 个样品为例：
加入组分                                                               体积
自备的总 RNA ，100ng/μL                                    2.0 μL
加尾和逆转录Buffer （含 dNTP 和 ATP）             5.5 μL
miRNA-polyA RT 引物                                            1.0 μL
E.coli polyA 聚合酶和   M-MLV 逆转录酶混合液    1.5 μL
合计                                                                         10 μL
7.   37℃保温 1 小时。
8.   加入 190μL 超纯水使得总体积为 200μL（稀释 20 倍） ，此样品将作为 cDNA模板用于 PCR 。未用完的 cDNA 20 倍稀释样品可以放-20℃至少两年以上。
二、染料法 qPCR
9.   按下表设置染料法 qPCR 反应 ，最好每个反应设置 3 个重复：
加入组分                                                    体积
2×SYBR PCR MasterMix                            10 μL
自备 Forward Primer ，5pmol/μL                1 μL
miRNA PCR 通用下游引物 ，5pmol/μL      1 μL
第 8 步所得 miRNA cDNA 20 倍稀释液      1 μL
超纯水                                                         7 μL
10.  建议反应程序设置如下：
循环                    温度                           时间

PCR 45 次        95℃                        15 秒
    （miRNA 特异 引物 Tm-5） ℃    15 秒
                            72℃                        20 秒
溶解曲线分析    根据 PCR 仪要求设定
11.  分析溶解曲线分析所得Tm（在 70-80℃之间一般表示扩增是特异的），分析Ct 值，分析标准曲线的斜率和 R2（如果用阳性对照做了标准曲线反应的话）。
关联产品    miRNA 纯化试剂盒