SYBR 绿染法细胞端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒产品说明书

主要用途
SYBR 绿染法细胞端粒酶活性TRAP 电泳分析试剂是一种旨在通过端粒酶体外合成端粒重复序列的引物延 展方法，继而进行多聚酶联扩增反应，在非变性聚丙烯酰胺电泳上呈现六碱基相间的阶梯图像，以分析和 评价活细胞端粒酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于肿 瘤、衰老等研究。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，染色清晰，重复性好。

技术背景
端粒重复序列扩增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶联扩增的敏感高效的 体外端粒酶活性的检测技术。首先，非端粒单核苷酸引物作为端粒酶的底物而持续延长产生六碱基差异的 片段；然后，延长所获得的产物在非端粒单核苷酸引物和逆向引物的参与下进行特异性扩增；内参引物的 整合用于定量酶活性。

产品内容    
裂解液（Reagent A）        毫升
反应液（Reagent B）        毫升
上样液（Reagent C）        微升
胶底液（Reagent D）        毫升
凝结液（Reagent E）        毫升
促进液（Reagent F）        微升
胶体液（Reagent G）       毫升
电泳液（Reagent H）        毫升
染色液（Reagent I）        微升
产品说明书                        1 份

保存方式    
保存裂解液（Reagent A）、反应液（Reagent B）、凝结液（Reagent E）和染色液（Reagent I）在－20℃冰箱 里，其余的保存在 4℃冰箱里；上样液（Reagent C）、胶底液（Reagent D）、促进液（Reagent F）、胶体液 （Reagent G）和染色液（Reagent I），避免光照，有效保证 6 月

用户自备
无离子水：用于稀释电泳液（Reagent H）和染色液（Reagent I） 细胞刮脱棒：用于细胞脱落
1.5 毫升离心管：用于细胞裂解的容器  0.5 毫升 PCR 管：用于扩增反应的容器
15 毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器
50 毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制和溶液混匀的容器
PCR 仪：用于扩增反应物
微型台式离心机：用于沉淀反应物
电泳仪：用于 TRAP 分子电泳分离
平式摇荡仪：用于染色反应
染色塑料盒：用于 PAGE 凝胶染色的容器
UV 自动成像仪或 PHOSPHORIMAGE：用于电泳染色记录

实验步骤
一、 样品制备
1 ． 准备 1 个细胞培养 6 孔板的单孔细胞，直至生长至 80％铺满率（1 X 105 细胞）
2 ． 小心抽去细胞培养液
3 ． 用细胞刮脱棒刮落细胞转移到 1.5 毫升离心管
4 ． 放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 3000g（或 6000RPM ，例如 eppendorf 5415）
5 ． 小心抽去上清液
6 ． 小心加入 xx 微升预冷的裂解液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
7 ． 放进冰槽里孵育30 分钟
8 ． （选择步骤）放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）
9 ． （选择步骤）小心移取上清液到新的 1.5 毫升离心管
10 ．移取 5 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用BCA 蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30031.1）
11．即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 扩增反应
1 ． 准备 2 个 0.5 毫升 PCR 管，置于冰槽里
2 ． 按照下表依次加入反应物

内容物                                  样品管                                阴性对照管
反应液（Reagent B）          48 微升                                 48 微升
细胞裂解悬液样品        2 微升（200 纳克细胞总蛋白）    ――
裂解液（Reagent A）        ――                                       2 微升
总量                                   50 微升                                  50 微升
3 ． 混匀
4 ． 30℃温度下孵育30 分钟
5 ． 即刻放进 PCR 仪，按照下表扩增
反应温度 (℃)    反应时间        反应循环
           94                90 秒              1
           94               30 秒        40注意：如果未见样品带，可以使用Tm 52 ，进行验证
           60               30 秒    
           72                60 秒    
6 ． 分别加入 xx 微升上样液（Reagent C）
7 ． 置入冰槽里等待上样

三、 垂直电泳分析
实验开始前，将胶底液（Reagent D）、凝结液（Reagent E）、促进液（Reagent F）和胶体液（Reagent G） 放进 37℃恒温水槽预热。然后进行下列操作。
1 ． 移出xx 毫升胶底液（Reagent D）到 15 毫升锥形离心管里
2 ． 加入 xx 微升凝结液（Reagent E）
3 ． 加入 xx 微升促进液（Reagent F）
4 ． 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
5 ． 在室温下孵育 45 分钟，或直至胶体凝结（注意：如果凝胶过快，建议减量凝结液（Reagent E）和促 进液（Reagent F））
6 ． 移出xx 毫升胶体液（Reagent G）到 50 毫升锥形离心管里（注意：根据胶体大小，使用适量的胶体液 （Reagent H））
7 ． 加入 xx 微升凝结液（Reagent E）
8 ． 加入 xx 微升促进液（Reagent F）
9 ． 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
10 ．插入 10 孔梳
11．在室温下孵育 45 分钟，或直至胶体凝结（注意：如果凝胶过快，建议减量凝结液（Reagent E）和促 进液（Reagent F））
12 ．移取 xx 毫升电泳液（Reagent H）到 500 毫升容器里，加入 450 毫升无离子水，混匀后，标记为电泳 工作液
13 ．加入适量的电泳工作液到电泳槽里
14 ．在 4℃环境下预运行 15 分钟，电压为 150 伏
15 ．上样：25 微升（注意：使用 20 碱基的 DNA marker）
16 ．继续 4℃环境下电泳 2 小时，电压为 150 伏，或直至溴酚蓝（Bromophenol Blue）染料移动到胶体三分 之二处
17 ．拆除电泳装置，取出电泳玻璃板块（注意：胶体脆弱）
18 ．分离玻璃板快，切除胶底
19 ．将胶体放进染色塑料盒里
20 ．加入 100 毫升无离子水
21 ．加入 xx 微升染色液（Reagent I）
22 ．置于平式震荡仪上，在室温下孵育 15 分钟，速度为 50RPM ，避免光照
23 ．小心取出胶体
24 ．小心使用保鲜塑料薄膜包裹胶体
25 ．即刻置于 UV 自动成像仪或 PHOSPHORIMAGE 下成像记录，并测算条带荧光强度
26 ．计算端粒酶活性：
所有阶梯条带荧光强度累加之和÷ 内参条带荧光强度＝相对 TRAP 活性

注意事项
1 ． 本产品为 20 次操作（包括 20 次裂解、40 次反应、4 次电泳）
2 ． 整个操作过程，须戴手套
3 ． 必须使用带滤芯的枪头
4 ． 所有器皿、离心管、液体等无 RNA 酶污染
5 ． 建议使用裂解液作为阴性对照
6 ． 内参分子大小为 36bp
7 ． 内参条带信号过弱，表明端粒酶活性过高，建议稀释或减少样品量；建议实验操作增加样品浓度梯度
8 ． 电泳前注意清洗样品孔
9 ． 电泳操作注意安全
10 ．染色时，避免光照
11．染色时间可以根据情况调整（参考图像如下：黑色箭头指示内参条带 36 碱基；括号区域表明六碱基相 间的阳性条带，起始条带为 50 碱基）
12 ．本公司提供系列 TRAP 实验技术产品

质量标准
1 ． 本产品经鉴定性能稳定
2 ． 本产品经鉴定无核酶污染
3 ． 本产品经鉴定显带清晰

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后， 应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证 说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告） 与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作 所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。


订购信息
单组分订购信息
   
编号                                                        名称                                                   规格
G&VS20106. 1E. 1          SYBR 绿染法细胞端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒        20 次
G&VS20106. 1E. 1A        裂解液（Reagent A）                                                  毫升
G&VS20106. 1E. 1B        反应液（Reagent B）                                                   毫升
G&VS20106. 1E. 1C        上样液（Reagent C）                                                   毫升
G&VS20106. 1E. 1D           胶底液（Reagent D）                                              毫升
G&VS20106. 1E. 1E         凝结液（Reagent E）                                              毫升
G&VS20106. 1E. 1F           促进液（Reagent F）                                              毫升
G&VS20106. 1E. 1G           胶体液（Reagent G）                                              毫升
G&VS20106. 1E. 1H           电泳液（Reagent H）                                              毫升
G&VS20106. 1E. 1I           染色液（Reagent I）                                              毫升

试剂盒订购信息

产品编号                                              名称                                       规格
G&VS20106. 1A. 1    同位素标记法细胞端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1A.2    同位素标记法组织端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1B. 1    荧光标记法细胞端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1B.2    荧光标记法组织端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1C. 1    银染法细胞端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1C.2    银染法组织端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1D. 1    溴化乙啶细胞染色法端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1D.2    溴化乙啶组织染色法端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1E. 1    SYBR 绿染法细胞端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106. 1E.2    SYBR 绿染法组织端粒酶活性 TRAP 电泳分析试剂盒    10 次
G&VS20106.2    端粒酶活性 TRAP 实时定量检测试剂盒    20 次