荧光标记法细胞端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒产品说明书
主要用途
荧光标记法细胞端粒酶活性TRAP电泳分析试剂是一种旨在通过端粒酶体外合成端粒重复序列的Cy5荧光染料标记引物延展方法，继而进行多聚酶联扩增反应，在非变性聚丙烯酰胺电泳上呈现六碱基相间的阶梯图像，通过影像仪器分析和评价活细胞端粒酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于肿瘤、衰老等研究。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，染色清晰，重复性好。
技术背景
端粒重复序列扩增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶联扩增的敏感高效的体外端粒酶活性的检测技术。首先，Cy5荧光染料标记非端粒单核苷酸引物作为端粒酶的底物而持续延长产生六碱基差异的片段；然后，延长所获得的产物在非端粒单核苷酸引物和逆向引物的参与下进行特异性扩增；内参引物的整合用于定量酶活性。Cy5是花青染料家系中的一种，用于标记核酸和蛋白。其水溶性好，对pH不敏感，通过氨基（amine）、硫基（thio）和醛基（aldehyde）特异性结合强。Cy5的激发波长为650nm，散发波长为670至700nm，在紫外波长下，同样显示荧光。在相关的影像仪器（PHOSPHORIMAGE）上进行分析。
产品内容
裂解液（Reagent A） 毫升
反应液（Reagent B） 毫升
上样液（Reagent C） 微升
胶底液（Reagent D） 毫升
凝结液（Reagent E） 毫升
促进液（Reagent F） 微升
胶体液（Reagent G） 毫升
电泳液（Reagent H） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存裂解液（Reagent A）、反应液（Reagent B）和凝结液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent B）、上样液（Reagent C）、胶底液（Reagent D）、促进液（Reagent F）、胶体液（Reagent G），避免光照，有效保证6月
用户自备
无离子水：用于稀释电泳液（Reagent H）
细胞刮脱棒：用于细胞脱落
1.5毫升离心管：用于细胞裂解的容器
0.5毫升PCR管：用于扩增反应的容器
15毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器
50毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制和溶液混匀的容器
PCR仪：用于扩增反应物
微型台式离心机：用于沉淀反应物
电泳仪：用于TRAP分子电泳分离
平式摇荡仪：用于染色反应
染色塑料盒：用于PAGE凝胶染色的容器
UV自动成像仪或PHOSPHORIMAGE：用于电泳染色记录和分析
实验步骤
一、 样品制备
1． 准备1个细胞培养6孔板的单孔细胞，直至生长至80％铺满率（1 X 105细胞）
2． 小心抽去细胞培养液
3． 用细胞刮脱棒刮落细胞转移到1.5毫升离心管
4． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
5． 小心抽去上清液
6． 小心加入xx微升预冷的裂解液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
7． 放进冰槽里孵育30分钟
8． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
9． 即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、 扩增反应
1． 准备2个0.5毫升PCR管，置于冰槽里
2． 按照下表依次加入反应物
| 内容物 | 样品管 | 阴性对照管 |
| 反应液（Reagent B） | xx微升 | 48微升 |
| 细胞裂解悬液样品 | 2微升（200纳克细胞总蛋白） | ―― |
| 裂解液（Reagent A） | ―― | 2微升 |
| 总量 | xx微升 | 50微升 |
3． 混匀
4． 室温下（30℃）孵育30分钟
5． 即刻放进PCR仪，按照下表扩增
| 反应温度（℃） | 反应时间 | 反应循环 |
| 94 | 90秒 | 1 |
| 94 | 30秒 |
30
|
| 52 | 30秒 | |
| 72 | 45秒 |
6． 分别加入5微升上样液（Reagent C）
7． 置入冰槽里等待上样
三、 垂直电泳分析
1． 移出xx毫升胶底液（Reagent D）到15毫升锥形离心管里
2． 加入xx微升凝结液（Reagent E）
3． 加入xx微升促进液（Reagent F）
4． 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
5． 在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
6． 移出xx毫升胶体液（Reagent G）到50毫升锥形离心管里
7． 加入xx微升凝结液（Reagent E）
8． 加入xx微升促进液（Reagent F）
9． 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
10． 插入10孔梳
11． 在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
12． 移取xx毫升电泳液（Reagent H）到500毫升容器里，加入450毫升无离子水，混匀后，标记为电泳工作液
13． 加入适量的电泳工作液到电泳槽里
14． 在4℃环境下预运行15分钟，电压为150伏
15． 上样：25微升（注意：使用20碱基的DNA marker）
16． 继续4℃环境下电泳2小时，电压为150伏，或直至溴酚蓝（Bromophenol Blue）染料移动到胶体三分之二处
17． 拆除电泳装置，取出电泳玻璃板块（注意：胶体脆弱）
18． 分离玻璃板快，切除胶底
19． 小心取出胶体
20． 小心使用保险塑料薄膜包裹
21． 即刻置于UV自动成像仪或PHOSPHORIMAGE下成像记录，并测算条带荧光强度
22． 计算端粒酶活性：
所有阶梯条带荧光强度累加之和÷内参条带荧光强度＝相对TRAP活性
注意事项
1． 本产品为10次操作（包括10次裂解、20次反应、2次电泳）
2． 整个操作过程，须戴手套
3． 必须使用带滤芯的枪头
4． 所有器皿、离心管、液体等无RNA酶污染
5． 建议使用裂解液作为阴性对照
6． 内参分子大小为36bp
7． 内参条带信号过弱，表明端粒酶活性过高，建议稀释或减少样品量；建议实验操作增加样品浓度梯度
8． 电泳前注意清洗样品孔
9． 电泳操作注意安全
10． 染色时，避免光照
11． 染色时间可以根据情况调整（参考图像如下：黑色箭头指示内参条带36碱基；括号区域表明六碱基相间的阳性条带，起始条带为50碱基）
12． 本公司提供系列TRAP实验技术产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定无核酶污染
3． 本产品经鉴定显带清晰
使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
单组分订购信息
编号 名称 规格
G&VS20106.1B.1 荧光标记法细胞端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 10次
G&VS20106.1B.1A 裂解液（Reagent A） 毫升
G&VS20106.1B.1B 反应液（Reagent B） 毫升
G&VS20106.1B.1C 上样液（Reagent C） 毫升
G&VS20106.1B.1D 胶底液（Reagent D） 毫升
G&VS20106.1B.1E 凝结液（Reagent E） 毫升
G&VS20106.1B.1F 促进液（Reagent F） 毫升
G&VS20106.1B.1G 胶体液（Reagent G） 毫升
G&VS20106.1B.1H 电泳液（Reagent H） 毫升
G&VS20106.1B.2 荧光标记法组织端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 10次
试剂盒订购信息
| 产品编号 | 名称 | 规格 |
| G&VS20106.1A.1 | 同位素标记法细胞端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1A.2 | 同位素标记法组织端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1B.1 | 荧光标记法细胞端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1B.2 | 荧光标记法组织端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1C.1 | 银染法细胞端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1C.2 | 银染法组织端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1D.1 | 溴化乙啶细胞染色法端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1D.2 | 溴化乙啶组织染色法端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1E.1 | SYBR绿染法细胞端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.1E.2 | SYBR绿染法组织端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 | 10次 |
| G&VS20106.2 | 端粒酶活性TRAP实时定量检测试剂盒 | 20次 |
