CAT#:JW-220315-5
低温运输、-20℃保存

随机引物法 DNA 探针生物素标记试剂盒


产品及特点
本产品是基于 Feinberg 和 Vogelstein 发明的随机引物标记法而开发出来的即用型  DNA 探针标记试剂盒 ，标记过程由双链 DNA 热变性、 随机引物与单链 DNA 结合、在  Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探针并掺入标记的核苷酸三步组成， 示意图请联系客服。

本产品对 Feinberg 和 Vogelstein 经典方法进行了改良 ，具有下列特点：
1.   提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分 ，简化了反应加样步骤 ，提高了标记反应的可重复性。
2.   使用无外切活性的 Klenow exo- DNA 聚合酶 ，已标记 DNA 探针不会被酶降解，探 针产量更高。
3.   快速 ，最快 1 小时即可完成标记反应。
4.   所需模版 DNA 量少 ，模板可以是线状或环状的、也可以是单链或双链的 ，但长度 必须在 100 bp 以上。
5.   得到的探针长度一般在 200-400 nt 之间（如果模板长度在 1kb 以上），可以用于 Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
6.   本产品足够 5 次 DNA 模板的生物素标记实验。
7.   本产品只能用于科研。
规格及成分                                   本产品使用五孔盒包装
成份                                                    编号         规格     包装
2×随机引物生物素标记反应液       220315a       50 uL    0.5mL 绿盖管
Klenow exo-聚合酶 ，2U/uL          220315e       5 uL     0.5mL 红盖管
超纯水                                            100935         1 mL    1.5mL 蓝盖管
使用手册                                            220315sc    1 份    无
                                        
运输及保存：低温运输 ，-20℃保存 ，有效期一年。
自备试剂：0.5M EDTA（ pH8.0），需要自备标记的核苷酸。
使用方法    
1.   在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分：
成分                                                用量
模板 DNA                                   50-150 ng
2×随机引物生物素标记反应液    10 uL
超纯水                                           补水到 19 uL
注意： 非同位素标记基团（如生物素和地高辛）疏水性强 ，易与塑料离心管表面非特 异性结合 ， 所以要硅化塑料离心管 。模板 DNA 并非越多越好 ，否则没有标记的模板 DNA 在杂交时会竞争性地抑制标记 DNA 跟靶分子的杂交 ，反而降低杂交信号强度。
2.   沸水浴 10 分钟，或在 PCR 仪上 100℃加热 10 分钟彻底变性模板 DNA，结束后需  要立即放冰上待用 。不能缓慢降温 ，否则变性的模板 DNA 单链又会杂交形成双链。
3.   离心数秒使所有液体集中在管底 ，再加入 1 uL Klenow exo DNA 聚合酶。
4.   轻柔吹打混匀 。如有液滴沾在管壁上 ，离心数秒使所有液体集中在管底。
5.   37℃保温 1-20 小时。标记效率跟模板量和保温时间相关，杂交需要一定量的探针， 同时在杂交时探针模板比越高 ，没有标记的模板 DNA 对杂交的竞争性抑制越低。
用户需要在这两者之间进行折衷选择 。具体可以参考下表：

模版 DNA 用量（ng）    1 小时后探针合成量 /探针模板比        20 小时后探针合成量 /探针模板比
10                                                        80ng/8                                900ng/90
30                                                     150ng/5                               1350ng/45
100                                                  350ng/3.5                                1650ng/ 16.5
300                                                 750ng/2.5                                2200ng/7.3
1000                                                1300ng/ 1.3                           2600ng/2.6
3000                                                1600ng/0.53                           2600ng/0.87
6.   反应结束后加热 100℃  5 分钟使 DNA 聚合酶变性，同时使 DNA 探针变性成单链。 变性后的标记反应液可以放-20℃长期保存，也可以直接加入到杂交反应液中进行杂  交 。如果电泳检测 ，标记产物将是弥散状态。
注意：本方法标记核苷酸掺入率极高 ，因此可以不经纯化直接使用 。如果需要纯化， 不要用酚抽提法纯化非同位素标记的 DNA 探针 ， 因为这些标记分子（如生物素或地高辛等） 疏水性强 ，能使标记的 DNA 进入疏水的有机相而丢失 。只能选择乙醇 直接沉淀或 Sephad ex G50 过柱回收（需另购柱式探针纯化试剂盒）。对比活高的 同位素标记探针 ， 由于同位素其极其不稳定 ， 因此应该立即使用 ，不要长久放置。
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