产品及特点       牙髓卟啉单胞菌（ Porphyromonas endodontalis）是一种革兰氏阴性细菌，

于 1976 年首先从感染牙齿根管中的产黑色素类杆菌群中分离出来，现已被认为是  感染牙齿根管生态环境中的核心细菌之一。而根尖牙乳头干细胞是年轻恒牙牙根生  理性发育与成熟的重要细胞学基础，故牙齿根管细菌感染对其细胞活性的影响关系  着年轻恒牙牙根继续发育的潜能 ， 因此快速检测牙髓卟啉单胞菌具有重要的意义。 本产品是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测牙髓卟啉单胞菌的试  剂盒 ，它具有下列特点：

1.   即开即用 ， 用户只需要提供样品 DNA 模板。

2.   引物经过优化 ，灵敏性高 ，分析灵敏度可以达到 100 拷贝/反应。

3.   提供阳性对照 ，便于制备标准曲线和排除无效实验。

4.   特异性高 ， 引物是根据牙髓卟啉单胞菌高度保守区设计 ， 不会跟其他生物的

DNA 发生交叉反应。

5.   本产品足够 50 次 20μL 体系的染料法荧光定量 PCR 反应。

6.   既可用于定性 ，也可用于定量 。 用于定量时线性范围至少 5 个数量级。

7.   本产品只能用于科研。

规格及成分                                本产品采用 5 孔盒包装

运输及保存  低温运输 ，-20℃保存 ，保存期限为 12 个月。

自备试剂  样品 DNA。

使用方法  一、稀释标准曲线样品（以 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例） 。 由于

标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样 品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不 提供活体样品做阳性对照 ，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1.   标记 6 个离心管 ，分别为 6 ， 5 ， 4 ， 3 ，2 ， 1。

2.   用带芯枪头分别加入 45  μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下

同）。

3.   在 6 号管中加入 5  μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分 钟 ，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。

4.   换枪头，在 5 号管中加入 5  μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充 分震荡 1 分钟 ，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。

5.   换枪头，在 4 号管中加入 5  μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充 分震荡 1 分钟 ，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。

6.   重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.   如果有 N 个样品 ，最好设置 N+2 个提取 ， 多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照） ，一个是 NC（样品制备阴性对照） 。可以用 10μL 第 6 步所得的第 4 号稀释液（ 1E4 拷贝/μL）再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要 求的起始样本体积一样 ， 以此作为 PC 。另外用水作为 NC。

8.   用自选方法纯化样品的 DNA ， 本试剂盒跟市场上大多数样品 DNA 提取试剂

盒兼容 ，也可使用本公司的免提取核酸释放剂。

三、染料法 qPCR 反应（ 20μL 体系 ，在样品制备室进行）

9.   如果做定量分析并且只做 1 次重复 ，则标记 N+9 个 PCR 管 ，其中 N+2 个用  于上步得到的 N+2 个样品 ， 1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板） ，6 个用  于标准曲线 。如果做定性分析 ，并且只做 1 次重复 ，则标记 N+4 个 PCR 管， 其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品 ， 1 个用于 PCR 阴性对照（用水做  模板） ， 1 个用于 PCR 阳性对照（用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模  板） 。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置 完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最 后加）：

成分

样品管 N+2 个

PCR 阴性 对照管

标准曲线

样品管（ 1-6 管）

2×SYBR qPCR MasterMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

牙髓卟啉单胞菌染料法 qPCR 引物混合液

2 μL

2 μL

各 2 μL

N+2 个待测 DNA 模板

8 μL

不加

不加

超纯水

不加

8 μL

不加

第 6 步所得标准曲线样品

不加

不加

各 8μL（2 号样到 2