CAT#:JW-15-00003 低温运输,-20℃保存

人端粒酶活性检测试剂盒 （探针法 TRAP）使用手册 V1.0

产品及特点    
端粒酶存在于 85-90%的肿瘤组织中 ， 因此通过检测端粒酶活性就有可能早期诊断大 多 数 肿 瘤 。 目 前 最 常 用 的 检 测 端 粒 酶 活 性 的 方 法 就 是 TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol ，端粒重复片段扩增) ，它利用端粒酶能在底物 DNA 末端添加不 同数量的 TTAGGG 序列这一特点 ，通过 PCR 检测延伸产物而高效检测端粒酶活性 。但 是传统的 TRAP 方法为终点电泳检测法 ，灵敏度低 ，没法定量 ， 同时还容易产生气溶胶污 染 。 为克服这些缺点 ， 本公司开发了基于探针法 qPCR 的 TRAP 试剂盒 。 它具有以下特 征：
1.   即开即用 ，提供从细胞裂解到 qPCR 所有试剂 ，免去自己优化条件。
2.   基于探针法荧光定量 PCR ， 比电泳法 TRAP 灵敏度高。
3.   使用探针 ，专一性比电泳法 TRAP 高。
4.   提供阳性对照 ，可以进行基于此对照的定量分析。
5.   一管式操作 ，免去气溶胶污染之忧。
6.   既可用于定量 ，又可用于定性 。 用于定量时线性范围至少有 5 个数量级。
7.   既可用于培养细胞 ，也可用于实体组织（包括肿瘤组织）。
8.   本产品足够 50 次 20 μL 体系的 TRAP PCR 检测。
9.   本产品只能用于科研。

规格及成分    
本产品采用小扁盒包装
编号                                                    编号                    规格                包装
TRAP 专用细胞裂解液                   15-00003a               10 mL       10 mL 本色瓶
2×TRAP 专用 qPCR MasterMix    15-00003b                0.5 mL        0.5 mL 本色盖
荧光 PCR 模板专用稀释液                180701                1.0 mL        1.5 mL 绿色盖
人 TRAP 检测阳性对照
（ 1E7 拷贝/μL）                               pc15-00003               50 μL        0.5 mL 黄色盖
人端粒酶底物干粉                           yw15-00003dx-TS            50 次        0.5 mL 白色盖
人 TRAP 引物-探针干粉                    yp15-00003dx                50 次        1.5 mL 棕色管
超纯水                                                   210806                    1 mL            1.5 mL 蓝色盖
使用手册                                               15-00003sc                1份                1 份

注意 ：首次使用本产品时需要在人端粒酶底物干粉中加入 55 μL 的超纯水； 人 TRAP 引 物-探针干粉管中加入 165 μL 的超纯水 。分别涡旋震荡 1 分钟溶解 ，短暂离心后放冰上 待用 。每次没有用完的需要放-20℃保存。

运输及保存：低温运输 ，-20℃保存 ，有效期 24 个月。
自备试剂：BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ， 固相 RNase 清除剂

使用方法   

一 ：标准曲线样品的制备
以阳性对照 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例 。 由于标准品浓度非常高 ， 因此 下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ，不能污染样品或本试剂盒的其他成分。
1.   标记 6 个离心管 ，分别为 6、 5、 4、 3、 2、 1。
2.   在 1-6 号管中加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液。
3.   在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的人 TRAP 检测阳性对照(试剂盒提供) ，充分震 荡 1 分钟 ，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。
4.   换枪头 ，在 5 号管中加入 5 μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1 分钟 ，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。
5.   换枪头 ，在 4 号管中加入 5 μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得) ，充分震荡1 分钟 ，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。
6.   重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线阳性样品 。放冰上待用。
二 ：端粒酶的提取
注意 ：端粒酶的组成成分中有 RNA ，极容易被降解 ， 因此 ，提取端粒酶应该跟提取 RNA 一样 ，尽量在低温条件下快速操作、 最好使用本公司的固相 RNase 清除剂预先 清洁试验台面等容易有 RNase污染的地方。
7.   对冷冻的实体组织 ：将 50-100 mg 在-80℃冷冻的组织放装有液氮的研钵中研磨成粉末 ，再转移到预冷的玻璃匀浆器中 ，加入 200 μL 预冷的 TRAP 专用细胞裂解液 ， 温和手动匀浆 6 次后冰浴 30 分钟 ，每间隔 5 分钟涡旋振荡一次 ，然后直接进入第 10 步操作。
注意 ：为保证裂解效果 ，可在显微镜下观察确保大部分细胞已经裂解 。如果组织样品 不足 50-100 mg ，可以按比例降低 TRAP 专用细胞裂解液用量 。在-20℃保存的实 体组织放置 2 个月后就失去端粒酶活性 ，而在-80℃保存的实体组织放置数年还有端 粒酶活性。
8.   对新鲜的培养细胞和组织： 用自备的预冷 PBS 洗涤 1E6 个经过胰酶处理的细胞或 50-100 mg 经过胰酶处理的新鲜组织 ， 3000 g 4 ℃离心 5 分钟 ，弃上清 ，细胞沉淀 可以直接使用 ，也可以放-80℃保存后续使用 。在细胞或组织沉淀中加入 200 μL 预 冷的 TRAP 专用细胞裂解液 ，轻柔吹打 3 次悬浮细胞或组织 。对新鲜细胞： 涡旋振 荡 10 秒后置冰浴 30 分钟 ，每间隔 5 分钟涡旋振荡一次 。对新鲜组织 ：在冰上用玻 璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴 30 分钟 ，每间隔 5 分钟涡旋振荡一次 。如果细胞不足 1E6 或 50-100 mg ，按比例降低 TRAP 专用细胞裂解液用量。
9.    14000 g 4 ℃离心 20 分钟 ，收集 160 μL 上清（含端粒酶）， 留 40 μL 不取。    
10. 取部分上清液用自备 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。
11. 测出各样品的蛋白浓度后 ， 用 TRAP 专用细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成 3 μg/μL ，然后分装合适的量到离心管中 ，将实验所需的数量放冰上待用 ， 其余的放- 80℃长期保存（可存放一年）。此步所得样本称为端粒酶待测样本。
12. 对每个样本 ，一次实验需要两管 ，一管用于测定端粒酶活性 ，一管用作该待测样本的 热灭活阴性对照 。制备方式是每个样本取一管端粒酶待测样本 ，95℃处理 10 分钟灭 活端粒酶 ， 放冰上待用 。 没有用完的可放-80℃长期保存（可存放一年） 供下次使用。
二 ：探针法 TRAP（ 20 μL 体系）
13. 确定端粒酶待测样本的： 为便于比较 ，每个反应所用的蛋白量总量（或对应的细胞 数）必须一样 ，否则不好进行样本间的比较。
14. 设置反应 。如果有 N 个样品 ，每个样品做 1 次重复（一般建议作三个重复 ， 此处为 表述方便 ，假设只做 1 次重复），则需要准备 2N+6 个反应管 。 多 1 倍是因为每个样 本都需要一个对应的热灭活阴性对照 。另外 1 个用作探针法 TRAP 阴性对照 ，最后 5 个用于标准曲线样本 。按下表设置 20 μL 体系的探针法 TRAP：

成份                       N 个  样品管      N 个热灭活阴性对照管    探针法TRAP阴性对照        标准曲线样品 管（ 1-6 管）
人端粒酶底物溶液         各 1 μL                  各 1 μL                              1 μL                                     1 μL
第 11 步所得
N 个端粒酶待测样本     各 1 μL                       -                                      -                                             -
第 12 步所得
N 个热灭活阴性对照样本    -                          各 1 μL                             -                                               -
TRAP 专用细胞裂解液        -                            -                                    1 μL                                       1 μL

第 6 步所得标准曲线样品 稀释液（ 1-6 号）                                           各 5 μL（ 2 号  样到 2 号管 ， 3号样到 3 管…）
人 TRAP 引物-探针混合液             各 3 μL           各 3 μL                         3 μL                                     3 μL
2×TRAP 专用 qPCR MasterMix    各 10 μL       各 10 μL                         10 μL                                    10 μL
超纯水                                     各 5 μL               各 5 μL                          5 μL                                          -
15. 吹打混匀后上机进行端粒延伸和 PCR 扩增 ，反应参数如下：

过程                            温度               时间
端粒延伸                     30℃    30 min
预变性                          95℃    5 min
PCR 反应                      95℃    15 sec
        （45 个循环）    57.5 ℃    15 sec    
                                     72℃    30 sec（采集 FAM 通道 ，淬灭基团 为 MGB）    
注 ：若使用 ABI 7500 qPCR 仪 ，复性温度 57.5 ℃需改为 48℃。    
    三 ：结果分析
16. 实验的有效性判断： 如果标准曲线样本管的 FAM 信号结果为阴性（无 Ct 值 ， 或者 大于或等于 35），则整个实验无效 ，不需要分析数据 ，需要重复实验或跟厂家联系 。 如果探针法 TRAP 阴性对照管的 FAM 信号结果均为阳性（有 Ct 值小于 35），说明 环境污染 ，则整个实验无效 ，不需要分析数据 ，需要跟厂家联系 。如果标准曲线样本 管的 FAM 信号结果为阳性 ，探针法 TRAP 阴性对照管的结果为阴性 ，则实验有效 ， 可以进入下步分析。
17. 标准曲线制作： 以 5 个标准曲线样本浓度的 log 值为横轴 ， 以阳性对照（ FAM 通 道） 的 Ct 值为纵轴 ， 绘制标准曲线 ， 阳性对照的标准曲线为斜线 ， r2 必须大于 0.95 。再以待测端粒样品的 Ct 值从阳性对照的标准曲线上推算出待测端粒酶所合成 的端粒重复序列的拷贝数的 log 值 ，再有此 log 值推算出新合成的端粒重复序列拷贝 数 。 由于新合成的端粒 DNA 重复序列的拷贝数跟端粒酶的活性相关 。 因此端粒酶活 性大小跟测试的 Ct 呈现反相关 ， 同一次实验所得的 Ct 值可以用来比较各所测各样 本中端粒活性的相对大小。
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