CAT#：JW-11-230510 低温运输及保存

原位细胞凋亡检测试剂盒， POD In Situ Cell Apoptosis Detection Kit, POD
使用手册 V1.0


产品及特点  细胞凋亡在许多生理过程中是至关重要的 。 目前已经描述了几种鉴定细胞凋亡的
方法。核内解离被认为是凋亡的关键生化事件，导致双链，低分子量 DNA 片段 以及高分子量 DNA  中的单链断裂。可以通过在酶反应中用修饰的核苷酸标记游 离的 3'-OH 末端来鉴定那些 DNA 链断裂 。 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可 以催化 DIG-dUTP 释放 3'-OH DNA 末端 。 DIG-dUTP 首先与生物素偶联的 抗地高辛抗体反应 ， 后者与链霉抗生物素蛋白（ SABC） 结合 。 结合 DAB ，在 显微镜下分析凋亡细胞染色黄色。

规格及成分                               
本产品使用大纸盒包装
成分                                             编号                    规格            包装
标记缓冲液                              11-230510a             5mL         10mL 棕色瓶
末端转移酶 ，20×                    11-230510b            100μL       0.5mL 红盖管
地高辛-11-dUTP 溶液 ，20×    11-230510c           100μL        0.5mL 蓝盖管
封闭剂                                      11-230510d            20mL         30mL 棕色瓶
生物素偶联抗地高辛抗体          11-230510e            100μL       0.5mL 绿盖管
SABC ， 100 ×                        11-230510f              100μL        0.5mL 红盖管
蛋白酶 K ，200 ×                     11-230510g            250μL         0.5mL 白盖管
抗体稀释液                               11-230510h             20mL          30mL 本色瓶
阳性对照样品                            11-230510i             2 样            塑料袋
使用手册                                   11-230510sc            1 份           无

运输及保存：低温运输及保存 ，有效期一年。
自备试剂：中性树胶、 NaCl、Tris 、 乙酸、 3 ％H 2 O 2、双蒸水、 二甲苯等

使用方法    
1.样品制备:
a.   对于细胞涂片：在室温下用  4％多聚甲醛固定  30-60  分钟，并用 PBS 冲洗两次 ，每次 2-5 分钟。
b.   对于冷冻切片：在室温下用  4％多聚甲醛固定  30-60 分钟，并用  PBS 冲洗两次 ，每次 2-5 分钟。
c.   对于石蜡切片：根据标准方案进行脱水和脱水组织切片 ，并用  PBS  冲 洗两次 ，每次 2 分钟。
2. 加入 50μL 新鲜制备的 3 ％H 2 O 2 ，并在室温下孵育  10  分钟。
3. 用双蒸水洗涤三次 ，每次 2 分钟。
4.用 0.01M TBS 将蛋白酶 K ，200 ×   to    1 ×  工作液。
5.   (0.01M TBS  的制备： 加入  8.5g NaCl,  1.2g Tris and 0.45-0.5 mL  乙 酸至  1L 双蒸水中 ，溶解 ，混匀 。)
6.   加入  20-100 μL  蛋白酶 K 工作液至样品中 (仅限石蜡切片，细胞和冷冻切 片不需要蛋白 K 消化） ，并在 37℃下消化  5-15 分钟 。 然后用 0.01M TBS 冲洗 3 次 ，每次 2 分钟 。反应混合物的制备 ：加入  1 μL 末端转移 酶 ， 20 × and 1 μL 地高辛-11-dUTP 溶液 ，20×至  18 μL  标记缓冲液 中 ，混匀。
7.   将反应混合物加入到样品中 ，在二氧化碳培养箱中 ， 37℃ ,  孵育  2  小时。
8.   用  0.01M  的  TBS  洗涤三次 ， 每次  2  分钟 。 Rinse with 0.01M TBS three times, 2 minutes each time.
9.   加入  50 封闭剂  ，室温孵育  30  分钟 ，丢弃阻断试剂 ，在此步骤无需洗涤样品。
10. 用抗体稀释液按照  1:100  的比例稀释生物素偶联抗地高辛抗体, 混匀 ，加入 50μL 至样品中。
11. 在二氧化碳培养箱中 ， 37℃ ,  孵育  2 小时
12. 用 0.01M TBS 洗涤 3 次,每次两分钟。
13. 用抗体稀释液按照  1:100  的比例稀释  SABC ，混匀，加入 50 μL 至样品中。
14. 在二氧化碳培养箱中 ， 37℃ ,  孵育  2 小时
15. 用 0.01M TBS 洗涤 3 次,每次五分钟。
16. Dilute 900 μL DAB Buffer (50 μL DAB Substrate (20 X) and 50 μL DAB Chromogen (20 X) to 850μL ddH2O and mix well.
17. 在每个载玻片上加入 50μLDAB 混合物 ，避光 ，并在室温下孵育 5-10 分钟。
18. 用双蒸水洗涤载玻片。
19. 用苏木素染液染色 5-10 分钟.
20. 用双蒸水冲洗两次 ，每次 5 分钟。
21. 75%乙醇中室温浸泡 5 分钟；
22. 85%乙醇中室温浸泡 5 分钟；
23. 95%乙醇中室温浸泡 5 分钟；
24. 二甲苯室温浸泡  15 分钟，
25. 中性树胶封片 ：加中性树胶盖玻片封片

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