硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒说明书 微量法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
货号：GV-W-A800
规格：100T/96S 产品内容：
诱导剂储备液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
提取液：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。试剂一：液体 15mL×1 瓶，-20℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 2mL 提取液溶解，可分装后-20℃保存，避免反复冻
融。-20℃保存 2 周。
产品说明：
NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3¯ +NADH+H＋→ NO2¯ +NAD＋ +H2O，NADH 在 340nm 下有特征吸收峰，340nm 下吸光值的变化即可表示酶活。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样品测定的前处理
1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可）避光， 浸泡 2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻 30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理）
2、称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。二、测定步骤
1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在 EP 管中加入下列试剂）
| 试剂名称（µL） | 测定管 | 空白管 |
| 样本 | 12 | - |
| 提取液 | 68 | 80 |
| 试剂一 | 108 | 108 |
| 试剂二 | 12 | 12 |
充分混匀后测定 340nm 下的初始值 A1，37℃反应 30min 后再次测定吸光值A2，计算△A 测定管=A1 测定管-A2 测定管，△A 空白管= A1 空白管-A2 空白管，△A=△A 测定管-△A 空白管。
注意：空白管只需测 1-2 次。
三、NR 活性计算：
1、按微量石英比色皿计算：
（1） 按样本鲜重计算：
酶活单位定义：每小时每 g 鲜重样品中消耗 1µmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。
NR（U/g 鲜重）=[∆A×V 反总÷（ε×d）×106]÷(W÷V 提取×V 样) ÷T=5.359×∆A÷W。
（2） 按样本蛋白浓度计算：
酶活单位定义：每小时每 mg 组织蛋白消耗 1µmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。
NR（U/mg prot）=[∆A×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样×Cpr) ÷T=5.359×∆A÷Cpr。
V 反总：反应体系体积，2×10-4L；V 样：吸取样本体积，0.012mL；V 提取：加入提取液体积， 1mL；T：反应时间，0.5h；ε：NADH 的摩尔消光系数：6220 L/mol/cm；d：比色皿光径：1cm；Cpr： 样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；106：单位换算系数，1mol=106nmol。
2、按 96 孔 UV 板计算：
将上述公式中的 d-1cm 换为 d-0.6cm（比色皿光径）进行计算即可
注意事项：
1、 当测定的吸光值大于 1.5 或者∆A 大于 0.5 时，建议将上清液稀释后测定。
2、 ∆A 测定过小（小于 0.01），可延长酶促反应时间。
3、 建议一次测定不要测定过多样品以免耽误过多的酶促反应时间。
4、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.05。
