羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择预期差异大的样本做预测定。
规格：100T/96S
产品内容：
提取液：6mol/L 盐酸， 自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1 ，室温保存。
试剂一：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。
标准品：0.5mL×1 支，0.5mg/mL 羟脯氨酸标准品，4℃保存。
产品说明：
HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此 HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样品经水解产生游离的 HYP ，进一步被氯胺 T 氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生 红色化合物，在 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样品水解液 560nm 吸光值，可计算 HYP 含量。
自备实验用品及仪器：
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、 6mol/L 盐酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、羟脯氨酸提取：
1 、组织：称取约 0.2g 样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入 2mL 的提取 液，煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小时消化至没有可见大的团块，16000rpm ，25℃ , 离心 20min（若离 心后仍有杂质，可通过过滤去除），用 10mol/L NaOH（约 1mL）调节 pH 值至 6～8 范围内。蒸馏水 定容至 4mL ，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物 质）
2. 细胞：取500 万个细胞，加入1mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至 6 小时消化至透明状，16000rpm， 25℃, 离心 20min ，用 10mol/L NaOH（约 0.5mL）调节 pH 值至 6～8 范围内。蒸馏水定容至 2mL， 取上清待测。
二、测定操作表：
1 、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 560nm ，蒸馏水调零。
2 、 将标准品稀释为 30 、15 、7.5 、3.75 、1.875 、0.938 、0.469 、0.234μg/mL 的标准溶液。
3 、 操作表
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| 空白管 | 测定管 | 标准管 |
| 样本 (µL） |
| 60 |
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| 标准溶液 (μL） |
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| 60 |
| 试剂一 (µL） | 60 | 60 | 60 |
| 混匀，室温静置 20min | |||
| 试剂二 (µL） | 60 | 60 | 60 |
| H2O (µL） | 180 | 120 | 120 |
| 混匀，60℃ , 20min 水浴，取出后室温静置 15 min ，取 200µL 于微量玻璃比色皿/96 孔板中检 测 A560 吸光值。ΔA=A 测定管-A 空白管 | |||
三、羟脯氨酸含量计算公式：
1. 标准曲线的绘制：
以标准溶液的浓度为x 轴，∆A 标准 (∆A =A 标准管-A 空白管）为 y 轴，绘制标准曲线，得到方 程 y=kx+b 。将∆A (∆A =A 测定管-A 空白管）带入方程得到 x。
2. 羟脯氨酸含量的计算：
（1） 按样本鲜重计算：
组织羟脯氨酸含量 (µg/g 鲜重）= x×V 样品÷（W×V 样品÷V 组提）=4x÷W。
（2） 按样本蛋白浓度计算：
组织羟脯氨酸含量 (µg/mg prot）= x×V 样品÷（Cpr×V 样品）=x÷Cpr。
（3） 按细菌或细胞数量计算：
细胞羟脯氨酸含量 (µg/104 cell）= x×V 样品÷（细胞数量×V 样品÷V 胞提）=2x÷细胞数量。
V 样品：加入的样品体积，0.06mL；V 组提：组织提取液体积，4mL；V 胞提：细胞提取液体积， 2mL；W ：样本鲜重，g；细胞数量：以 104 为单位，万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1 、 OD 值大于 1.0 ，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2 、 试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3 、 按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
