仅供科研使用，不得用于临床检验。
人溶血磷脂酰胆碱（LPC） ELISA Kit
说明书
【产品名称】
通用名称：人溶血磷脂酰胆碱（LPC）定量检测试剂盒（ELISA）
英文名称：Human Lysophosphatidylcholine ELISA KIT
【包装规格】
96T/48T
【预期用途】
仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中溶血磷脂酰胆碱（LPC）的浓度。
【检验原理】
本试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗溶血磷脂酰胆碱（LPC）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人 溶血磷脂酰胆碱（LPC）校准品和待测样本，再加入HRP标记的人 溶血磷脂酰胆碱（LPC）抗原（酶标抗原），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-酶标抗原的免疫复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人 溶血磷脂酰胆碱（LPC）的浓度负相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人 溶血磷脂酰胆碱（LPC）的浓度。
【主要组成成分】
主要成分
| 组分 | 数量 | 主要成分 | 开封后储存 |
| 校准品 | 0.35ml/管 | -- | 2-8℃14天 |
| 包被微孔板 | 96T/48T | 预包被固相抗体 | 2-8℃14天 |
| HRP标记抗原 | 10mL | HRP标记的检测抗原 | 2-8℃180天 |
| 底物液A | 6mL | 0.01%过氧化氢 | 2-8℃180天 |
| 底物液B | 6mL | 0.1%TMB | 2-8℃180天 |
| 终止液 | 6mL | 2mol/L稀硫酸 | 2-8℃180天 |
| 20×浓缩洗涤液 | 25mL | 0.05%Tween20 | 2-8℃180天 |
| 说明书 | 1份 | -- | -- |
| 自封袋 | 1个 | -- | -- |
| 不干胶 | 2片 | -- | -- |
标准品浓度依次为：1000、500、250、125、62.5、0 ng/mL
本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。
需要但未提供的材料及耗材
1、酶标仪
2、精密移液器及一次性吸头
3、蒸馏水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、500ml量筒
7、无粉一次性乳胶手套
【储存条件及有效期】
1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。
2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。
【适用仪器】
半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。
【样本要求】
样本类型和采集
以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。
1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
4、组织匀浆：用预冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心 5-10分钟，取上清检测。
样本保存和稳定性
样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。
【检验方法】
试剂准备
1、使用前，所有的组分都要至少复温30min，确保充分复温到室温。
2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。
操作程序
按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。
除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原100μL。
用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。
所有孔加入终止液50μL，在450波长的酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
【实验结果计算】
检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。
如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。
【检验方法的局限性】
1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、使用试剂盒配套的样品稀释液。
5、如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。
6、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。
【产品性能指标】
外观和物理检查:试剂盒应组分齐全，内外包装均应完整，标签清晰，液体试剂无渗漏。各组分装量不少于表1中要求。
线性: 用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），在62.5 ng/mL – 1000 ng/mL范围内，剂量-反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于0.9900。
精密度
3.1分析内精密度:试剂盒质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于15.0%。
3.2批间精密度:在三个不同批次产品之间，质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于15.0%
最低检出限:最低检测浓度小于1.0 ng/mL。
质控品测定值: 每次检测结果均应在允许范围内。
【注意事项】
生物安全
1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。
3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。
技术提示
1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
废物处理
所有使用或未使用的试剂，所有污染性的一次性材料，应当遵循传染性或潜在传染性产品的处理程序，每个实验室都有责任根据其实验的类型和危险性级别，进行废物和污物的处理，同时要严格依照有关规定对待所有的废物和污物。
